Séquençage

[JOK]

Bonjour,

J'ai juste une petite question, dans les projet de séquencage de génome de grande taille l'utilisation de vecteur est nécessaire. Je sais que la séquence d'ADN que l'on veut étudier doit être scindée afin de placer les inserts obtenus dans des vecteurs. Ces vecteurs seront ensuite clonés à l'aide d'organisme hôtes... Ensuite on aplique la technique classique de séquençage (Sanger) ou le pyroséquençage.
Il me semble logique qu'avant d'appliquer la digestion enzymatique pour l'obtention des inserts on soit obligé d'effectuer une PCR, est-ce le cas?

Merci d'avance, bonne fin de journée

[Vinc]

Salut!
Tu coupes avec une enzymes et tu clones tes fragments dans des BAC dont tu connais la séquence. Tu parts d'une grande quantité de génome donc pas besoin de PCR, tu coupes tout et tu insères tout ça dans tes BAC pour créer une banque d'ADNg. Comment veut tu faire une PCR sur un génome dont tu ne connais pas la séquence?

A+
Vinc

[JOK]

DOnc puisque la séquence génomique est inconnue, selon toi il est impossible d' effectuer une PCR....car le problème réside dans les amorces nécessaire à cette étape....mais suite à l'amplification de nos insert dans les vecteurs....il faudra bien que l'on dessine des amorces pour que la méthode de Sanger puisse fonctionnée. Tu pourrais m'éclairer parcque plus j'approfondis plus je m'y perd.....
Merci d'avance

[dirtncross]

c'est une bonne question.....
ne prend t on pas les séquences du BAC flanquantes de l'insert pour la PCR de séquence ????

[Hiro]

Bonjour,

J'ai juste une petite question, dans les projet de séquencage de génome de grande taille l'utilisation de vecteur est nécessaire. Je sais que la séquence d'ADN que l'on veut étudier doit être scindée afin de placer les inserts obtenus dans des vecteurs. Ces vecteurs seront ensuite clonés à l'aide d'organisme hôtes... Ensuite on aplique la technique classique de séquençage (Sanger) ou le pyroséquençage.
Il me semble logique qu'avant d'appliquer la digestion enzymatique pour l'obtention des inserts on soit obligé d'effectuer une PCR, est-ce le cas?

Merci d'avance, bonne fin de journée

bonsoir,
qui dit PCR dit primers,
et qui dit primers dit... séquence connue!
bref un séquençage génomique commence souvent par un shotgun,
à moins qu'il s'agisse d'un variant de forte homologie avec un wt connu.
HTH,
Hiro

[Hiro]

DOnc puisque la séquence génomique est inconnue, selon toi il est impossible d' effectuer une PCR....car le problème réside dans les amorces nécessaire à cette étape....mais suite à l'amplification de nos insert dans les vecteurs....il faudra bien que l'on dessine des amorces pour que la méthode de Sanger puisse fonctionnée. Tu pourrais m'éclairer parcque plus j'approfondis plus je m'y perd.....
Merci d'avance

rebonsoir,
pour séquencer un fragment inconnu on peut commencer par utiliser les primers universels du vecteur (lac, m13 reverse, T7 etc),
puis dès que le séquençage est "entré" dans l'insert c'est cette séquence nouvellement determinée qui sert à synthétiser les primers suivants.
on procède ainsi de proche en proche ce qui permet d'avancer assez rapidement,
avec un génome dont le GC content est correct il est possible de lire de longs strech de plus de 500bp avec une très bonne fidélité,
par contre pour des génomes AT riches comme celui de P. falciparum c'est une autre paire de manches!
Hiro

[JOK]

Merci pour toutes les précisions apportées...Bonne journée

[Lord M]

Salut !

Il est possible d'amplifier un génome inconnu grâce à l'utilisation d'amorces universelles et/ou dégénérées. C'est la méthode utiliée pour l'identification bactérienne par RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

Cependant cette méthode n'est d'aucune aide pour un séquençage car les morceaux amplifiés obtenus seront répartis aléatoirement dans le génome. Un séquencage classique commence donc en général par la création d'une banque d'ADNg.

[Hiro]

Salut !

Il est possible d'amplifier un génome inconnu grâce à l'utilisation d'amorces universelles et/ou dégénérées. C'est la méthode utiliée pour l'identification bactérienne par RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

Cependant cette méthode n'est d'aucune aide pour un séquençage car les morceaux amplifiés obtenus seront répartis aléatoirement dans le génome. Un séquencage classique commence donc en général par la création d'une banque d'ADNg.

oui c'est aussi ce qu'on appelait "random priming" dans le temps,
c'est de cette façon qu'on fait les sondes marquées pour les hybridations.
OK pour les prokaryotes mais pas très adapté dans le cas de génomes complexes?
Hiro