Triple marquage HIS/Immuno

[Sophie Croizier]

Bonjour,
Je rencontre quelques difficultés pour arriver à obtenir un triple marquage Lhx9 (HIS), calbindine et une hormone (Ac polyclonal).
Mon protocole me fait passer par une étape de postfixation des coupes à la PFA 1%, puis une préhybridation et l'hybridation pendant une nuit. Le lendemain je fais la post hybridation (SSC2X, Ac anti DIG, différents tampon et PBS) puis je dépose mon premier Ac monoclonal dilué dans du PBS triton (Calbindine) après avoir fait un bain de PBS triton 0,1% 30 minutes puis le lendemain le secondaire et après le 2eme Ac polyclonal dans du PBS BSA 1% puis le secondaire et enfin après des rincages, la suite de la manip d'HIS avec la révélation par du NBT/BCIP.
Mon Ac polyclonal ressort avec un très bon marquage en revanche l'Ac monoclonal ressort très mal de même que l'HIS.
Je ne comprend pas très bien pourquoi, peut etre encombrement stérique pour le monoclonal? Que pourrais je faire pour améliorer ces marquges?
Le double marquage calbindine, et l'hormone marche très bien.
D'avance merci pour vos conseils
Sophie

[Akïn]

Bonjour,

As tu testé tes anticorps seuls au préalables à différentes concentration ???

Si ca n'est pas le cas, tu pourrais, à partir de ces résultats en déduire la concentration optimale à utiliser.

Petite remarque toute bête mais auquelle une de mes stagiaire n'avait pas songé. Les anticorps secondaires doivent être gardé à l'abris de la lumière même pendant l'incubation

Akïn

[Sophie Croizier]

Bonjour,
Oui j'ai déjà testé ces deux anticorps séparément et ensemble, le marquage est vraiment intense avec peu de fond.
En ce qui concerne le secondaire, je prends bien toutes les précautions nécessaires.
Sophie

[Akïn]

Rebonjour,

La question est là encore très bête mais bon ... doit bien y avoir une solution a ton problème

Quel milieu de montage utilises tu pour tes échantillons.

Personellement, j'utilise le Mowiol. Ce réactif, que je dilue dans du glycérol se concerve vraiment très bien et surtout évite le bleeching de ta préparation.

Essai eventuellement avec d'autres milieu de montage. Si tu as un problème en associant plusieurs marquage, c'est que tu as peut etre un de tes marquage qui provoque l'exitation d'un autre marqueurs tout proche.

Regardes tu tes échantillons en épifluorescence ou confocal ?

Akïn

PS: pour ce qui est des milieux de montage, si tu penses que le problème peut venir de cette étape, je peux tenter de me renseigner voir si je trouve d'autres milieu que le mowiol. Pour info (et de mémoire), le DAPI permet d'éviter le bleeching de ta préparation. Il s'agit d'un agent fluorescent qui va aler se localiser au niveau du noyau de ta cellule. AAprès, comme tu utilises deja un triple marquage, il faut voir les filtres dont tu disposes dans ton labo.
Bon courage.

[Sophie Croizier]

Bonsoir,
J'utilise du PBS triton - glycérol (v/v) pour monter mes lames. Cela marche très bien en temps normal. En ce qui concerne le dapi, je m'en sert deja pour d'autres manip, je vais essayer et voir.
Je me disais que peut être la chaleur de l'HIS (60°C), pouvait modifier l'accessibilité de l'Ac à la calbindine, faut que je fasse des tests, avec seulement un chauffage et la calbindine,
vendredi j'ai eu de meilleurs résultats en rajoutant des bains de triton ms evidemment, partout sauf sur mon niveau d'intéret,
je vais essayer a nouveau cette semaine, je verrai bien.
Merci pour tous ces conseils
Sophie

[Sophie Croizier]

rebonsoir,
je regarde mes coupes au microscope a épifluorescence.