Variations sur un thème de synthétase...

[MaliciaR]

Bonjour,

J'ai un léger souci avec mon cher TD diffusé par mon prof chéri Il a décidé qu'on le faisait avant le cours dessus, question de nous bouger un peu les neurones...

Mais bon. Voici la chose:
On a observé chez certaines bactéries comme E.coli 20 ARNt-synthétases, mais chez d'autres, comme S. pneumoniae il n'y en a que 19. Ainsi, S. pneumoniae n'a pas de glutaminyl-ARNt-synthétase (GlnRS), mais possède en revanche une glutamyl-amido-transférase (gat) qui convertit le ARNt^Gln qui a été chargé d'un acide glutamique (par la GluRS) en Gln-ARNt^Gln par un mécanisme de transamidation :
E.coli : ARNt^Gln + glutamine -> Gln-ARNt^Gln

S. pneumoniae : ARNt^Gln + ac. glutamique(+GluRS) -> Glu-ARNt ^Gln + gat -> Gln-ARNt^Gln

1) Dans le but d'étudier la répartition de ces 2 mécanismes, une étude est menée par a) analyse de séquence pour les bactéries dont le génome a été séquencé, et b) par PCR dans les autres cas.
Q.1. Quelle stratégie devez-vous employer pour choisir les amorces spécifiques des deux gènes (E. coli et S. pneumoniae)? (On s'intéresse aux gènes d'une sous-unité de la Glu-amidotransférase = gatB et de la GlnRS).

Je sais interpreter mon gel, mais cette question d'oligos m'échappe... J'ai pensé à des histoires d'anticodon -> codon -> séquence ADN, mais ça ne m'a pas l'air convaincant... Donc?
Merci.

(Pour les arbres, après ).

Cordialement,

[jmbowie]

Bonjour,


< S. pneumoniae sans GlnRS mais (gat) qui convertit le ARNtGln chargé Glu en Gln par transamidation >

1) Dans le but d'étudier la répartition de ces 2 mécanismes, une étude est menée par a) analyse de séquence pour les bactéries dont le génome a été séquencé, et b) par PCR dans les autres cas.
Q.1. Quelle stratégie devez-vous employer pour choisir les amorces spécifiques des deux gènes (E. coli et S. pneumoniae)? (On s'intéresse aux gènes d'une sous-unité de la Glu-amidotransférase = gatB et de la GlnRS).

(Pour les arbres, après ).

Je pense que l'analyse des séquences de chaque gène au sein de l'ensemble des bactéries au génome séquencée permet de repérer les régions les plus conservées, ce qui permet de dessiner les oligos sur ces régions. Ainsi, il est possible de rechercher tel ou tel gène par PCR dans les organismes étudiés en étant relativement confiant lorsque l'on a un résultat positif en PCR (une bande à la bonne taille).

[MaliciaR]

Donc, pour toi, on fait un alignement multiple, puis on fait une PCR avec des primers dégénérés?

[jmbowie]

Donc, pour toi, on fait un alignement multiple, puis on fait une PCR avec des primers dégénérés?

Pas forcément. Si tu trouves un motif spécifique très bien conservé, tu peux tenter de dessiner l'oligo sans le dégénérer. Mais ce serait peut-être plus prudent en effet.

[piwi]

Alignement multiple n'est peut être pas le mieux. Il vaut mieux utiliser quelque chose tel que EMBOSS align (pairwise alignment)
Ca ne change pas grand chose par rapport à un programme type clustal mais l'algorithme est fait pour ça, donc l'alignement sera de meilleur qualité. Autant en profiter.


Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Oki doki
Suite des évènements...
Sur le gel, on a vu que chez E. coli il y a une bande qui correspond à GlnRS et chez S. pneumoniae non, alors qu'elle a une bande qui est gatB (absente chez E. coli). Ô surprise...

2) Analyse phylogénétique des glutamyl-(GluRS ou E) et glutaminyl-ARNt-synthétases (GlnRS ou Q) de divers Eucaryotes (H. sapiens, C. elegans, L. luteus, G. muris, S. cerevisiae) et Bactéries (E. coli, V. cholerae, H. influenza, N. gonorrhea, P. aeruginosa, D. radiodurans) a été réalisée. C. elegans et D. radiodurans possèdent 2 copies de GluRS (E1 et E2).
On a en résultat un arbre pour GlnRS et un autre pour GluRS. Celui de GluRS est très semblable à celui obtenu avec les autres ARNt-synthétases des mêmes organismes. En revanche, l'arbre des GlnRS semble différent.
Ils ont donné les bootstraps, c'est gentil, ainsi qu'indiqué que la longueur des branches horizontales est proportionnelle à la divergence de séquence observée.

Et là, pour décrire les arbres... Pas de scanner à la maison

Donc, l'arbre GlnRS (en PJ).

Q.1. Quelle(s) hypothèse(s) feriez-vous pour expliquer l'aspect différent de l'arbre obtenu avec la GlnRS, notamment la moindre longueur de ses branches?

La seule chose que je connaisse sur la longueur des branches est que cela reflète les vitesses différentes auxquelles "les horloges moléculaires" ont bougé. Autrement dit, cela inclut le fait que l'on a affaire à l'arbre le plus parcimonieux mais on prend en compte le fait que les changements n'apparaissent pas à vitesse constante. Est-ce cela?

Merci, Piwi

[jmbowie]

Oki doki

coli: 1 bande GlnRS
S. pneumoniae non, mais 1 bande gatB

2) (GluRS ou E) et (GlnRS ou Q)

de divers Eucaryotes et Bactéries

C. elegans et D. radiodurans possèdent 2 copies de GluRS (E1 et E2).

On a en résultat un arbre pour GlnRS et un autre pour GluRS. Celui de GluRS est très semblable à celui obtenu avec les autres ARNt-synthétases des mêmes organismes. En revanche, l'arbre des GlnRS semble différent.
Ils ont donné les bootstraps, c'est gentil, ainsi qu'indiqué que la longueur des branches horizontales est proportionnelle à la divergence de séquence observée.

Et là, pour décrire les arbres... Pas de scanner à la maison

Donc, l'arbre GlnRS (en PJ).

Q.1. Quelle(s) hypothèse(s) feriez-vous pour expliquer l'aspect différent de l'arbre obtenu avec la GlnRS, notamment la moindre longueur de ses branches?

Le fait que l'arbre des GlnRS présente des branches plus petites indique qu'il y a une divergence moindre entre les différents représentants de cette protéine extraits de différents organismes:
- soit ils 'agit d'un gène qui évolue plus lentement que le gène de GluRS
- soit elle est apparue plus récemment, elle a eu "moins le temps pour diverger" que GluRS qui est une protéine à la fonction très semblable

[MaliciaR]

Le fait que l'arbre des GlnRS présente des branches plus petites indique qu'il y a une divergence moindre entre les différents représentants de cette protéine extraits de différents organismes:
- soit ils 'agit d'un gène qui évolue plus lentement que le gène de GluRS
- soit elle est apparue plus récemment, elle a eu "moins le temps pour diverger" que GluRS qui est une protéine à la fonction très semblable

Donc, c'est bon quand je disais :

Autrement dit, cela inclut le fait que l'on a affaire à l'arbre le plus parcimonieux mais on prend en compte le fait que les changements n'apparaissent pas à vitesse constante.

C'est cela qui est à la base de ton raisonnement ici, je me trompe?

Merci en tout cas, c'est super sympa

[jmbowie]

Donc, c'est bon quand je disais :

C'est cela qui est à la base de ton raisonnement ici, je me trompe?

Merci en tout cas, c'est super sympa

Oui, c'est surtout l'idée que tos les gènes n'évoluent pas tous à la même vitesse ni à vitesse constante.

De rien, cela me fait du bien aussi!

[MaliciaR]

D'accord, merci Vive la culture générale, parfois ça sert quand même...

Sinon, il y a une dernière question qui m'échappe un peu... (les autres ça va ). En fait, dans l'arbre GluRS il y a un truc bizarre : les deux paires E1 et E2 chez C. elegans et D. radiodurans. En fait, tu as E1 de C. elegans dans un groupe avec H. sapiens (branches courtes), alors que E2 de C. elegans et E1 de D. radiodurans sont dans un autre groupe mais avec des branches 3 fois plus longues... E2 de D. radiodurans est groupe extérieur de ce dernier, branche énooorme.
Si je demande trop, tu le dis. Je ne le prendrai pas mal

[jmbowie]

D'accord, merci Vive la culture générale, parfois ça sert quand même...


arbre GluRS il y a un truc bizarre : les deux paires E1 et E2 chez C. elegans et D. radiodurans:

- tu as E1 de C. elegans dans un groupe avec H. sapiens (branches courtes),
- E2 de C. elegans et E1 de D. radiodurans sont dans un autre groupe mais avec des branches 3 fois plus longues
- E2 de D. radiodurans est groupe extérieur de ce dernier, branche énooorme.
Si je demande trop, tu le dis. Je ne le prendrai pas mal

Donc en gros les GluRS de tous les organismes ne sont pas apparentées. Cela suggère que la protéine a été inventée par la nature plusieurs fois, mais à partir de protéines différentes. Il y aurait une sorte d'évolution convergente pour la fonction mais pas forcément pour la séquence; cela peut aussi expliquer pourquoi il y a deux copies de GluRS dans chacune de ces bactéries et que ces 2 copies ne soient pas fortement apparentées.

Il y a peut-être un arbre de GlnRS-GluRs qui laisse penser que le GluRS ait pu être inventée à partir du GlnRS ou l'inverse?

[MaliciaR]

Donc en gros les GluRS de tous les organismes ne sont pas apparentées. Cela suggère que la protéine a été inventée par la nature plusieurs fois, mais à partir de protéines différentes. Il y aurait une sorte d'évolution convergente pour la fonction mais pas forcément pour la séquence; cela peut aussi expliquer pourquoi il y a deux copies de GluRS dans chacune de ces bactéries et que ces 2 copies ne soient pas fortement apparentées.

La protéine serait inventée plusieurs fois? Mais pourquoi? Je veux dire, s'il y a une évolution convergente ensuite pour la fonction, c'est que cette protéine est importante, donc sa perte aurait dû être contre-sélectionnée... Non?

Il y a peut-être un arbre de GlnRS-GluRs qui laisse penser que le GluRS ait pu être inventée à partir du GlnRS ou l'inverse?

Non. En revanche, il y a l'arbre de la question suivante qui permet peut-être d'expliquer la chose. En fait, on y voit qu'au sein des Eubactéries il y a (grossièrement) 3 groupes :
(1) groupe possédant seulement une amido-transférase S. pneumoniae, mais aussi D. radiodurans qui a également la Gln-ARNt-synthétase);
(2) un autre - seulement une Gln-ARNt-synthétase (E. coli, H. influenza);
(3)un troisième - possédant les deux enzymes (P. aeruginosa, N. gonorrhoeae).

[MaliciaR]

Mais pourquoi, si D. radiodurans possède les deux enzymes, il aurait deux GluRS différentes...?
Sinon, le groupe où sont E. coli et H. influenza est concordant avec la proximité qu'ils ont sur l'arbre.
Idem pour P. aeruginosa et N. gonorrhoeae.

Mais alors D. radiodurans...

[jmbowie]

La protéine serait inventée plusieurs fois? Mais pourquoi? Je veux dire, s'il y a une évolution convergente ensuite pour la fonction, c'est que cette protéine est importante, donc sa perte aurait dû être contre-sélectionnée... Non?

La protéine a pu être inventée chez plusieurs organismes, c'est ce que j'entendais par plusieurs fois. Elle aurait pu être crée à un moment de l'Evolution ou il a paru judicieux d'augmenter le nombre d'AA entrant dans la synthèse d'AA (je m'avance un peu là )

[QUOTE=MaliciaR;1515431]
Non. En revanche, il y a l'arbre de la question suivante qui permet peut-être d'expliquer la chose. En fait, on y voit qu'au sein des Eubactéries il y a (grossièrement) 3 groupes :
(1) groupe possédant seulement une amido-transférase S. pneumoniae, mais aussi D. radiodurans qui a également la Gln-ARNt-synthétase);
(2) un autre - seulement une Gln-ARNt-synthétase (E. coli, H. influenza);
(3)un troisième - possédant les deux enzymes (P. aeruginosa, N. gonorrhoeae)

Je croyais que les E.Coli avaient une GluRS?

[MaliciaR]

La protéine a pu être inventée chez plusieurs organismes, c'est ce que j'entendais par plusieurs fois. Elle aurait pu être crée à un moment de l'Evolution ou il a paru judicieux d'augmenter le nombre d'AA entrant dans la synthèse d'AA (je m'avance un peu là )

Ah ok... Je vois mieux

Je croyais que les E.Coli avaient une GluRS?

Non, c'est une Gln qu'elles ont
Pourquoi cette remarque? Je veux dire, c'est cohérent ce que tu as énoncé