PCR et témoin négatif

[missy12]

sur mon gel d'agarose j'observe une bande dans la colonne de mon puit contenant le témoin négatif.
est-ce normal?
merci

[IngDr]

En général non, mais tout dépend de la taille de la bande. Ca peut être les amorces, des dimères d'amorces, voire de la matrice, s'il y en avait beaucoup. Une petite photo du gel pourrait aider.

Cordialement

[missy12]

merci pr ta réponse !

une autre question, comment faire pr estimer la taille des bandes sachant que l'on dépose 7µL de produits PCR mais que la ladder correspond a 500ng d'ADN

[IngDr]

j'ai pas bien compris ta question ! Rien n'est comparable dans ce que tu viens d'écrire.
Relis toi et tu verras ...

[missy12]

benh en fait je ne sais pas comment faire pour estimer la quantité relative d'ADN present

[IngDr]

merci pr ta réponse !

une autre question, comment faire pr estimer la taille des bandes sachant que l'on dépose 7µL de produits PCR mais que la ladder correspond a 500ng d'ADN

ceci est incompatible.
Quelle est ta question : quantifier la quantité d'ADN obtenu ou estimer la taille du produit de PCR ?

[missy12]

je veux évaluer la taille des bandes (en pb)
et estimer la quantité relative en ng/µL

[IngDr]

Le ladder, est ce un "vraie" échelle de taille, auquel cas c'est facile d'estimer la taille du produit de pcr par rapport aux tailles connues pour le ladder. (la vraie méthode consistant a faire une courbe étalon log(taille)=f(distance migrée dans le gel), et d'utiliser cet étalon pour retrouver la taille de la bande en fonction de sa migration).
Concernant la quantité relative. En général pour les ladders commerciaux, on peut connaitre la quantité d'ADN pour une ou plusieurs bandes du marqueurs de taille. Apres il faut comparer l'intensité du produit de PCR avec l'intensité des bandes du marqueurs de taille.
Mais cette méthode n'est que tres approximative. L'idéal serait de faire une gamme d'une quantité connue et de comparer.

[missy12]

merci bcp de ton aide