Analyse de l'expression du gène fos

Bonjour

Je suis étudiante en master de neurosciences du comportement et dans le cadre d'un de mes modules, j'ai de la biochimie. Or je viens de psychologie (:mad2:) donc je vous laisse deviner tout de suis mon souci :S:

J'ai fais un TP sur l'analyse de l'expression du gène fos et avec mon binôme on a pas mal de souci pour le compte rendu.:sos:

Nous avons fais une PCR qui a ce que j'ai lu dans pas mal d'endroit sert à amplifier les ARN (ou ADN bien sur). Le souci c'est que nous ne voyons pas du tout quoi analyser avec ceci. On a 4 sondes : Fos-Dig, GAPDH-dig, fos et GAPDH.

[URL=http://img61.imageshack.us/my.php?image=pcrgroupe1gf5.jpg][IMG]http://img61.imageshack.us/img61/8568/pcrgroupe1gf5.th.jpg[/IMG][/URL][URL=http://g.imageshack.us/thpix.php][IMG]http://img61.imageshack.us/images/thpix.gif[/IMG][/URL]

On nous a parlé en cours d'une courbe logarithmique... et même avec les explications trouvées à droite et à gauche nous ne comprenons tjrs pas.

Ensuite on a réalisé un northern blot. On voit bien GAPDH et on a fos vers t = 30 min. La pas trop de souci (:dance:) mais est ce que nous sommes censé determiner la taille de fos?

Je sais que ca fait bcp de questions, surtout que je ne suis pas super précise non plus mais c'est les vacances et notre prof de biochimie n'est pas là donc impossible de trouver ces renseignements ailleurs.

Merci par avance,
Dithy

Bonjour,

Votre image est très petite et un peu inexploitable en l'état. Il sera difficile de vous aider avec ce document. Pourriez vous en produire une version plus grande (et éventuellement la charger sur le serveur futura-sciences via la fonction "gérer les pièces jointes" qui se trouve en bas de la case dans laquelle on rédige les messages.)

Cordialement,
piwi

Merci pour le conseil :) J'ai rechargé l'image !

(sinon en cliquant sur l'image, elle apparait en gros dans une nouvelle fenêtre)

Bonjour à tous, je suis le binome de Dithy !
Allez répondez nous ^^ on galère !
Bye

Si vous pouviez expliquer exactement en quoi consiste ce TP ca aiderait parce que là on a du mal à cerner ce que vous voulez montrer avec ce gel.
Pourquoi les deux premières colones portent le même nom mais ne montrent pas la même chose? Idem pour les deux dernières?
Pourquoi Fos Dig a-t-il la même taille que Fos qui lui même a une autre taille que dans la colone suivante? Idem pour GAPDH à coté...

En l'état rien ne s'explique.

Pourriez vous préciser les conditions qui ont permi d'obtenir l'ADN de chacune des colones?

Cordialement,
piwi

Ca va être difficile de répondre à ces questions, vu que nous ne comprenons pas nous même à quoi a servi ce gel. (Peut etre pour vérifier que les sondes étaient correctes).

En fait le but du tp et de montrer à quel temps la transcription de fos est la plus forte. On est parti de cellules cancereuses auxquelles on a rajouté un stimulant. On a laissé ce stimulant 0 min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 minutes (il y a donc 5 boites de pétri).

Donc première étape : Stimulation des cellules, extractation et dosage des arn.
2nde étape : Northern Blot
Ensuite : hybridation et revelation avec marquage de la sonde fos et gapdh par incorporation de Dig-UTP (d'ailleurs on ne sait pas ce qu'est Dig UTP) puis préhybridation et hybridation.

Je sais pas si c'est très clair mais ca résume les différentes étapes de notre TP.

Mais vous devez bien savoir à quelle condition correspond chacune des colonnes non?

Le couplage UTP-dig (dig pour digoxine) est un classique pour marquer de manière non radioactive les sondes. La synthèse des sondes se fait par transcription (de plasmides en général) ou par PCR et l'UTP marqué est incorporé dans dans le transcrit/amplicon comme un UTP ou un TTP . On peut enuite révéler la présence de la dig de plusieurs manières.

Si j'ai bien compris, l'étape de PCR vous sert à produire les sondes. Donc le gel est un contrôle de la qualité de vos sondes. Reste à comprendre pourquoi il y aurait plusieurs fois la même à des tailles différentes. Mais peut être que je me trompe sur le rôle de la PCR dans votre protocole. Pour l'instant, je ne peux être certain de rien sur la base de vos seules explications. Vous n'avez pas un protocole à scanner?

Cordialement,
piwi

Notre TP fait 5 pages et j'ai pas de scanner ici.

La PCR semblerait elle plus juste sous cette forme? (voir nouvelle pièce jointe).

Comment peut on calculer la taille des ARN à partir de cela?

Oui la photo est plus compréhensible ainsi. (Pourquoi ça a changé d'ailleurs?)
Pour ce qui est de la détermination des tailles des bandes il vous faut procéder à partir des bandes présentes dans le marqueur de poids moléculaire que vous avez déposé dans la première et la dernière colonne (les échelles). Normalement on a du vous donner les tailles de chacune des bande qui le compose. Deux manières de procéder:
1. A la louche. Vos bandes sont très proches d'une bande du marqueur. Ils doivent avoir sensiblement la même taille.
2. Précis. La migration se fait de manière logaritmique en fonction de la taille. Elle est donc linéaire en fonction du logaritme de la taille.
Vous tracez donc une droite en coordonnée semilog (log (taille); distance de migration) à partir de votre marqueur. Ensuite vou pouvez retrouver la taille en utilisant cette droite.

Je pense qu'en TP c'est la méthode 2 qui est attendue.

Cordialement,
piwi

Merci beaucoup d'avoir répondu :)

On avait inversé en fait pour les noms sur notre photo.

Donc c'est bien la méthode 2 qui est attendu de nous, mais on n'a jamais fait ca donc ca ne va pas être facile. surtout qu'on ne nous a pas donné les tailles de chacune des bandes (on devrait pouvoir les récuperer, tout du moins on espère).

Merci encore pour votre aide.

[QUOTE=Dithy;1979738]Merci beaucoup d'avoir répondu :)

On avait inversé en fait pour les noms sur notre photo.

Donc c'est bien la méthode 2 qui est attendu de nous, mais on n'a jamais fait ca donc ca ne va pas être facile. surtout qu'on ne nous a pas donné les tailles de chacune des bandes (on devrait pouvoir les récuperer, tout du moins on espère).

Merci encore pour votre aide.[/QUOTE]

Pesonellement, je ne trouve pas de différence entre les 2 photos et je ne peux en déduire quelque chose !
Il y a sans doute une erreur qui vous échappe dans l'annotation de puits et les sondes utilisés (ou même une erreur de manipulation et/ou mélange ou inversement des échantillons par exemple?!!)

Revoyez votre photos et vérifiez bien les étapes, les noms et les conditions de l'expérience pour que quelqu'un puisse vous aider au mieux.

Entre la photo 1 et 2 on avait inversé le nom des puits. La 2nde photo est juste (on a pu voir notre prof). Le puits de GAPDH (puits 2) n'a pas fonctionné. Sinon le reste est juste.

Par contre, pour la courbe faite à partir des puits 1 et 9, on est censé avoir une droite ou une courbe?

Nan j'ai rien dit ! On a une droite c'est bon. (j'ai fait un nouveau message car j'ai pas pu éditer le précédent).

Merci à tous ceux qui ont répondu ! C'est vraiment sympa.
Une dernière question toutefois :
Nous avons conclu par dire que le gène fos était précoce et transitoire, mais, quelle est l'utilité de ce genre de gène ? Ma question est vague, je sais.

Merci d'avance