Western blot eNOS

[petitdudup]

Bonjour

Je cherche depuis quelques temps a faire un western blot en utilisant un anticorps dirigée contre la serine 1179 phosphorylée de eNOS, sans succès.J'ai essaye plusieurs quantités de protéines, j'ai refait toutes mes solutions, j'ai vérifié les pH a chaque fois. Je fait un bon transfert puisque le bleu de coomacy ne montre aucune trace de protéine sur le gel apres transfert (2h, 80V). J'ai egalement essaye d'autres anticorps dirigés contre peNOS mais rien y a fait.

En revanche, lorsque je fait des mise au point, ca marche. La seule différence est que je fait ces mises au point sur tissu (hypothalamus) fraichement prélevé et broye, alors que je fait mes vrais manips sur des tissus broyes et congeles dans l'azote liquide immédiatement apres.

Quelqu'un til une explication ? Cela peut il provenir de l'etape de congelation ?

Merci
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[Vinc]

Oui!
Votre congélation n'est peut être pas assez rapide! Ou alors c'est lors de la décongélation qu'il y a un problème. Mais peu importe si vous avez trouvé un protocole qui fonctionne.
Les protéines phosphrylées sont classiquement plus sensibles que les protéines non modifiées. Vous pourriez également essayer d'ajouter des inhibiteurs de phosphatases mais a priori la congélation immédiate doit résoudre le problème.

V.

[petitdudup]

Pourtant, les animaux sont sacrifies, leur hypothalamus est preleve et place dans un ependorf contenant du tampon de lyse (plus des antiproteases) plongé dans un bac de glace. La dessus nous broyons les echantillons au precyllis (temperature maintenue a 4 degres), le surnageant est recupéré puis mis dans un nouvel ependorf qui est jeté dans l'azote liquide. Je pense donc que nous respectons assez bien la chaine du froid