Induction de protéines GST

[invitee91b1528]

Bonjour à tous,

je viens poser une question sur le forum car je commence à être désespérée.
Je tente depuis 3 mois maintenant de produire ma protéine d'intérêt qui se trouve dans le vecteur pGEX-6P-1 qui me permet normalement d'obtenir une protéine fusionnée à la GST. Ma première expérience a été fructueuse puisque j'ai pu induire avec de l'IPTG ma protéine fusionnée, jusque là tout va bien. Le problème est qu'en refaisant exactement la même manip, je n'arrive plus à induire l'expression de ma protéine (en tout cas non visible sur un gel acrylamide en coloration coomassie). J'ai tout de même fait un WB et la protéine est présente mais en très faible quantité. J'ai essayé de nombreuses variations de mon protocole et là franchement j'arrive à court d'idée. Brièvement, mes tentatives ont été:
- une gamme de concentration en IPTG
- une gamme temps d'induction des protéines
- gamme de température pour l'indution
- utilisation de différents milieux de culture bactérienne
- utilisation de différents tampons de lyses bactérien avant dépôt sur gel d'acrylamide
- changement d'aliquot d'IPTG
Bref, je suis un peu désespérée.
J'espère qu'il y a parmi vous quelqu'un qui pourra m'aider à résoudre ce problème.
Merci d'avance pour vos réponses
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[invitee91b1528]

J'ai oublié de préciser que je suis dans des bactéries BL21 (DE3).

[piwi]

Est ce que vous refaites une nouvelle transformation à chaque fois ou est ce que vous avez une boite stock?
Si vous refaites une transfo à chaque fois, le lot de bactérie compétantes a-t-il changé?
Si vous avez une boite stock est elle vielle? (quelques semaines? Mois?)

Pour le dépot sur gel il n'y a aucun tampon de lyse à utiliser. Vous prenez par exemple 10 µl de votre culture, vous les mettez dans le laemmli et c'est parti.
Sinon une question se pose encore. Si je comprends bien vous n'avez réussi qu'une fois à produire votre protéine. Etes vous certaines que ce n'était pas un artéfact? Il serait dommage de s'acharner alors qu'au fond ça n'a jamais vraiment fonctionné.

Dernière question pour l'instant: est ce une grosse protéine?

Cordialement,
piwi

[invitee91b1528]

Salut Piwi,
Pour répondre à tes questions, au début, j'étais repartie d'une colonie que j'avais repiqué sur boite ampi. N'ayant pas eu de résulats, je suis repartie de mon glycérol stock mais toujours rien. Je n'ai pas retenté de transformer à nouveau dans des bactéries mais je pense que je vais essayer, voir ce que ça donne.
En ce qui concerne l'induction, j'ai pu voir la bande de ma protéine GST 2 fois (avec un long mois entre les 2), et j'ai aussi pu voir ma bande avec un Ac spécifique de ma protéine et un Ac spécifique de la GST sur WB, donc apparemment j'arrive à la produire (peut être à un niveau basal) mais pas suffisamment pour la voir en coomassie.
Pour le dépôt, je centrifuge mes cultures puis je reprend le culot dans un tampon ESB puis je chauffe à 95°C un aliquot de 15 µl, il y a peut être une meilleure méthode mais ça a toujours marché pour mes collègues qui ont fait migrer des protéines.
Sinon, ma protéine fait 33 KDa et 59 KDa lorsqu'elle est fusionnée avec la GST.

Merci d'être intervenu rapidement,

Cordialement,
Christp

[A voir en vidéo sur Futura]

[mantOs]

Ta protéines a-t-elle beaucoup de codons rares ?

Si oui essaye avec des souches bactos adaptées (genre rosetta )

[invitee91b1528]

Non elle n'en a pas j'ai déjà regardé

[piwi]

Pour la taille il n'y a rien de catastrophique, ça devrait pouvoir se faire. Je m'inquiétais du tampon de lyse car j'avais peur que vous fassiez une extraction qui aurait éliminé les corps d'inclusions. Mais votre méthode revient à peu près au même que de directement lyser les bactos en laemmli. Donc c'est pas là qu'il faut chercher.
En général pour ce genre de chose il vaut mieux avoir une boite stock et taper dedans pour faire un starter puis un grosse culture que l'on induit à l'IPTG. Le truc c'est que la boite stock ne doit pas être trop vielle. Dans les protocoles il est souvent écrit que pour l'induction IPTG il n'est plus nécessaire de mettre de l'ampi (normalement votre inoculum est ampi^R). Personnellement je préfère en mettre quand même. Ca ne gène pas et ca évite qu'un satellite se développe.

Sinon il y a un test que vous n'avez pas fait et qui pourrait être intéressant. Normalement de base on induit à l'IPTG quand on a une bonne concentration en bactéries (DO = 0.6). Certaines fois il faut induire quand il y a moins de bactéries ou quand il y en a plus. Vous pourriez essayer différents temps de début d'induction.
Encore une chose, vous avez essayez différents temps d'induction. Mais quel est votre temps de référence? Avez vous essayez plus court? Si de base vous essayez 4h, avez vous essayé 2h voir 1h?
Je dis cela parce que j'ai eu l'expérience d'une protéine qu'il vallait mieux ne pas laisser trop longtemps.

La production d'une protéine GST peut être un long et pénible parcours. Courage!

Cordialement,
piwi

[invitee91b1528]

En fait, je fais une pré-culture O/N à 37°C dans du LB-ampi puis le lendemain, je rajoute du milieu LB sans ampi et je contrôle la DO avant d'induire à l'IPTG. J'ai fait des tests en induisant à une DO de 0,6 et maintenant suite à des conseils provenant d'un autre labo, j'attends une DO de 1 pour induire.
Je peux tenter de faire l'induction à une DO moins forte, peut-être que...

Sinon, pour l'induction en elle-même, j'avais une référence de 3 heures à la base mais n'obtenant plus le résultat voulu j'ai fait, cette semaine, une gamme temps d'induction de 1 à 7 heures mais en fait je ne peux rien conclure car mon contrôle positif (pGEX-6P-1 seul produisant la GST) n'a pas fonctionné. Je vais donc refaire cette manip car là, je n'ai pas vraiment eu d'informations...

Cordialement,
Christp

[piwi]

Ma méthode est la suivante.
Préculture LBampi O/N puis dilution au quart le lendemain avec du LBampi. J'induis immédiatement avec de l'IPTG
En fait, tout cela est assez protéine dépendant.

En général ce que l'on fait c'est que l'on essaie déjà d'induire un peu la protéine à taton puis on optimise. Notez quand même que parfois on n'arrive pas à avoir beaucoup de protéines. Essayez déjà de la voir en sel d'argent puis en WB. Dés fois on ne voit rien en dehors du WB et il n'y a rien à faire. Vous pouvez optimiser pour améliorer la détection en WB et ensuite jouer sur la quantité de bactos préparées. Faites en 5L si il le faut. Le LB et l'IPTG ne coutent pas si cher

[invitee91b1528]

Merci du conseil j'attendais toujours d'avoir une DO supérieure à 0,6, j'avais pas essayé avec une DO inféreure.
J'essaie dès que possible et je vous tiens au courant.

[invitee91b1528]

J'ai essayé d'induire ma protéine de fusion avec en faisant une gamme de DO avant induction (0,1<DO<1) et là HOURRA je peux voir ma protéine après coloration au bleu de coomassie (et je ne la vois plus à forte DO). Je vais refaire une gamme temps maintenant en espérant voir une "patate".

Merci du conseil piwi

Cordialement,
Christp

[piwi]

Ravi d'avoir pu vous aider à retrouver le moral
Bon courage pour la suite. Pensez bien quand même qu'une patate ne vous sera pas très utile (ou difficilement utilisable) si tout se trouve dans les corps d'inclusions. Mieux vaut ne pas avoir un faible rendement et que tout soit exploitable, on joura alors sur le volume, que le contraire où là on n'a aucun levier.
Si vous avez encore quelques soucis pour la suite, vous connaissez l'adresse du forum.

Cordialement,
piwi

[invitee91b1528]

Oui c'est vrai.

En tout cas merci encore

Christp

[invite3029ab01]

Merci de tout vos réponse, grâce à vous je pourrai éviter pas malles d'étapes