Tampon d'extraction

[botrytis]

Bonsoir,
j'aurais une question a poser à ceux qui s'y connaissent en préparation de solutions d'extraction. c'est la première fois que je manipule et mon tampon d'extraction est à base d'SDS, on m'indique que pour chaque échantillon, il faut 1ml de tampon EDTA 50mM, SDS 2% pH8

1-faut-il incorporer le SDS en solution directement dans de l'EDTA?
2-faut-il ajuster le pH avant ou après?
3-peut-on autoclaver la solution finale qui contient du SDS? (on m'a informé que le SDS ne s'autoclavait pas).

PS: c'est ma première extraction d'ADN, je n'ai jamais eu à le faire auparavant, alors un peut d'indulgence. Merci

[LXR]

Bonjour,

Vous mettez votre SDS dans la solution d'EDTA à 50 mM puis vous ajustez le pH à la fin. Il n'y a aucune raison d'autoclaver le tampon. Si vous tenez vraiment à le stériliser vous pouvez le passer dans un filtre de porosité 0,2 µm.

PS: c'est ma première extraction d'ADN, je n'ai jamais eu à le faire auparavant, alors un peut d'indulgence. Merci

Aucun problème, on réagit tous de la même façon face à une nouvelle expérience : avec beaucoup d'interrogations.

Greg

[botrytis]

Merci infiniment LXR. vous avez tout à fait raison, j'ai lu que le filtre à porosité était très utilisé pour ce type de solution. une autre question me titille beaucoup et j'ai oublier de la posée.

Concernant le volume!! supposons que je veuille préparer 100ml de tampon. ça implique la préparation de l'EDTA à 50mM (ça, je sais faire; théoriquement), le problème c'est le volume du SDS à 2%, j'ai pensé à la règle C1V1=C2V2 mais je bute à chaque foi.

[LXR]

Si votre SDS est à 20%, alors il faut le diluer au 1/10ème dans le tampon. Vous en faites 100 ml donc 100/10 = 10 ml de SDS dans 90 ml de tampon (car 90+10 = 100 ml volume final)
Après il vous faut adapter ce calcul en fonction de la concentration en SDS initial mais en principe il est vendu à 20%

Greg

[vpharmaco]

Bonjour,

Au cas où tu aurais du SDS pur sous forme de poudre, il faut savoir qu'en general les % sont exprimés en poids/volume. Par exemple, une solution de SDS à 2% veut dire qu'il faut 2g de SDS dans 100 mL de volume.

[botrytis]

Merci LXR et vpharmaco pour vos réponses, je confirme avec vous beaucoup d'incertitudes.

Alors j'ai passé la nuit d'hier soir à potasser et je suis peut être (je n'en suis pas sure) arrivée à trouver la recette que je veux valider avec vous si ça ne vous embête pas

alors pour mes 100 ml de 50mM d'EDTA, SDS 2% à pH8 je procède de la manière suivante:

1-je prépare 100ml d'EDTA à 0,05M (50mM) à savoir: 1,86g d'EDTA dans 100ml d'eau distillée ajusté à pH8

2-je prend 90ml d'EDTA 0,05M auxquels je rajoute 2g d'SDS pure (2%)

3-j'ajuste le pH à 8 (encore une fois ) et je complète à 100ml avec de l'EDTA 0,05M

je ne sais pas si ça tien la route, vous en pensez quoi???

[LXR]

Le pH ne se mesure qu'à la fin, quand ton tampon est terminé, que les 100 ml sont atteints. Pas besoin d'ajustement de pH intermédiaire. Pour le reste, c'est bon.

Greg

NB : habituellement on ne tient pas compte du volume que représente une poudre et on l'ajoute directement dans le volume final, ici 100 ml.

[botrytis]

Super!!!!
tu me rassure, si pour le reste tout est ok, je fonce dès demain au labo et je je mets la main à la pâte. en tout cas je te remercie, tu m'a été d'une grande aide

[botrytis]

Bonjour,
je suis passé au laboratoire ce matin et j'ai préparé ma petite sauce, seul bémolle pH de la solution est instable, car des cristaux d'SDS ou d'EDTA précipitent au fond du flacon et ne se dissolvent pas dans l'eau, conséquences le pH est à 8 au repos, puis il descend à 7,2 lorsque j'ajite!!!! est-ce que c'est normale

[JohnG]

Non, ce n'est pas normal que tes poudres ne se disolvent pas. Est-tu sur de ce que tu as pesé ?
Combien de temps as-tu l'aissé sous agitation ? parfois cela peut prendre un certain temps avant d'atteindre la dissolution compléte de tes poudres.
Enfin, l'ajustement du pH doit toujours se faire sous agitation.

Bon courage

[botrytis]

Salut JohnG, pour la pesée, j'ai fais très attention (1,86g d'EDTA disodique pour 50mM+ 2g d'SDS pour 2% dans 100ml d'eau distillée)

par contre, j'ai pas pensé à l'agitation (novice que je suis). je corrige ça et je vous informe en cas de pépins ...euuuh plutôt en cas de grumeaux

[piwi]

Plutôt que de préparer ce genre de solution à partir de poudres je vous conseille de vous faire des solutions stock concentrées d'EDTA (500mM c'est pas mal) et de SDS (10-20%). Une fois celles ci prêtes il sera bien plus simple de réaliser le tampon de lyse.
Sinon je ne pense pas qu'il soit bon de mesurer le pH au volume final. Si vous devez ajuster de manière importante (essayez avec de l'acide maléique pour rigoler) vous n'aurez plus aucune marge de manoeuvre et votre volume sera faussé. Il vaut mieux prendre le pH à disons 9/10 du volume final.

Cordialement,
piwi

[botrytis]

Bonjour Piwi,

pour les solutions stock c'est pas mal comme idée mais comment savoir quel volume d'SDS ajouter pour avoir une solution à 50mM d'EDTA, SDS 2%?
et puis pour le pH, il ne m'a fallu que quelques micro litres d'NaOH 10N pour ajuster, ces derniers faussent -ils réellement le volume???

[piwi]

Si vous avez une solution de SDS 20% et qu'il vous faut une solution à concentration finale 2% il suffit de diluer 10 fois votre stock. Je ne vois pas bien le problème. Si vous ne faites pas comme cela il va vous falloir repeser les poudres à chaque fois (avec les variations que cela engendre), remettre tout cela en suspension (avec le temps que cela prend). Pas forcément pour le seul buffer de lyse d'ADN. On trouve du SDS dans les tampons pour l'analyse de l'ADN mais aussi pour l'analyse des protéines. Ca va être coton de faire un gel de polyacrylamide en pesant le SDS.
Pour le pH sur cette solution ça se passe bien (en principe le pH est donné par le tris). En revanche comme je le signalais, si vous préparez une solution d'acide maléique ou de glutamine vous risquez d'avoir un problème si vous testez le pH au volume final.

Maintenant, c'est vous qui voyez...

[botrytis]

Oui je suis d'accord avec vous (entièrement), d'autant plus que je suis appelée à préparer mon gel après mon extraction, c'est juste que mon protocole n'est pas clair du tout, le seul élément que j'ai, c'est cette fameuse formule "1ml d'EDTA 50mM, SDS 2% à pH8" d'ailleurs je ne me serais jamais sortie sans l'aide des membres du forum, donc j'y vais à taton sans pour autant connaitre les voies les plus efficaces.

D'ailleurs je me permet une question! que comprenez vous en lisant la formule en gras??