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séparation au ficoll

  1. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
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    37

    séparation au ficoll

    Bonjour;
    je souhaite séparer au ficoll les PBL de souris et je voudrai savoir si le protocole de séparation utilisé habituellement sur les PBL humain est applicable sur ceux de la souris ?! on m'a dit qu'il se peut que ça ne marche pas à cause de la diférence de dencité ! es ce que qlq un a déja fait ça ?!
    merci

    -----

     


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  2. fabien.che

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Localisation
    IDF
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    401

    Re : séparation au ficoll

    Salut,

    J'en fais sur des cellules humaines de sang de cordon mais je ne sais pas si cela change beaucoup au niveau du protocole pour les souris.

    J'ai regardé chez mon fournisseur, il n'y a que très peu de différence entre les milieux de séparation pour l'homme et la souris (même densité : 1,077 g/mL - osmolarité homme : 280-300, osmolarité souris : 270-290, pH identique).

    Pour le rat par contre, ça diffère plus.
     

  3. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
    Messages
    37

    Re : séparation au ficoll

    Voila j'ai fais ma manipe de séparation au ficoll pour des prélévements de foie foetaux de souris et malheureusement sur 56 millions de cellules avant ficoll je n'en ai récuparé qu'à peine 8 millions ! vous en pensez quoi ?
     

  4. fabien.che

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Localisation
    IDF
    Messages
    401

    Re : séparation au ficoll

    Du foie ?

    J'ai du mal à comprendre la démarche là... je croyais qu'il s'agissait de PBL ?

    Après... moi je ne compte jamais mes cellules totales avant la séparation, déjà parce que ça ne me sert à rien et surtout parce c'est "pollué" par les rouges...

    Mais le principe d'une séparation au ficoll c'est quand même d'enlever un maximum de cellules non désirées... donc c'est plutôt pas mal d'éjecter 46 millions de cellules...

    Quel est le but de votre manip ?
     

  5. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
    Messages
    37

    Re : séparation au ficoll

    Citation Envoyé par fabien.che Voir le message
    Du foie ?

    J'ai du mal à comprendre la démarche là... je croyais qu'il s'agissait de PBL ?

    Après... moi je ne compte jamais mes cellules totales avant la séparation, déjà parce que ça ne me sert à rien et surtout parce c'est "pollué" par les rouges...

    Mais le principe d'une séparation au ficoll c'est quand même d'enlever un maximum de cellules non désirées... donc c'est plutôt pas mal d'éjecter 46 millions de cellules...

    Quel est le but de votre manip ?

    ha ha j'ai dis PBL pour faire simple !
    en faite j'essaye de récupérer les cellules souches de foie foetal à partir de foetus prélevé à 14 jour de géstation ! mais je trouve vraiment que le nombre de cellules récupéré aprés ficoll est trés bas !!
     


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  6. fabien.che

    Date d'inscription
    décembre 2009
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    IDF
    Messages
    401

    Re : séparation au ficoll

    Il est difficile de répondre, on ne connait pas vos conditions d'extraction.

    A quoi correspondent les 50 millions de cellules totales ?

    Après, si le nombre de cellules récupérées vous parait quand même très bas, il y a différents points à regarder.

    Les paramètres de centrifugation ? Avez-vous bien récupérer tout l'anneau cellulaire ? Que sais-je encore...
     

  7. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Viroflay
    Âge
    32
    Messages
    5 168

    Re : séparation au ficoll

    a mon avis, il ne doit pas y avoir énormément de cellules souches a ce stade de gestation...
     

  8. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
    Messages
    37

    Re : séparation au ficoll

    bonjour
    50 million de cellules corespond à 4 foie foetaux approximativement juste prélevés et broyés pour obtenir une suspension cellulaire
    mes conditions de centri sont 2000rpm à20° pdt 45mn sans acélération ni frein
     

  9. fabien.che

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Localisation
    IDF
    Messages
    401

    Re : séparation au ficoll

    Ce qui fait une énorme quantité d'hépatocytes, entre autres. Donc ce n'est pas si surprenant d'avoir un nombre ce cellules final si différent de l'initial.

    Un tri magnétique en suivant permettrait aussi d'enrichir vos 8 millions de cellules restantes, car il ne s'agit pas de 8 millions de cellules souches !
     

  10. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
    Messages
    37

    Re : séparation au ficoll

    oui c vrai mais je ne veux pas que des cellules souches car elles on quant même besoin des autres cellules pour survivre je pense ( ou plutot je l'ai lu qlq part !)
     

  11. LXR

    Date d'inscription
    avril 2007
    Localisation
    Genève (CH)
    Messages
    3 926

    Re : séparation au ficoll

    Il est vrai que les interactions cellulaires hétérotypiques qu'on retrouve in vivo sont importantes, mais de là à être indispensable à la survie de cellules souches en culture où le milieu est rempli de facteur de croissance, j'en doute fort... Ou alors ce sont des cellules souches particulières... Tu peux préciser ta source (de "ce que tu as lu quelque part")?

    Greg
     

  12. fabien.che

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Localisation
    IDF
    Messages
    401

    Re : séparation au ficoll

    De plus, vous n'avez aucun moyen de vous assurer que les cellules qui restent sont celles qui participent à l'homéostasie des cellules souches.

    Il y a même un grand risque pour que ce genre de co-culture induisent une différenciation des cellules souches. Voire même, qu'elles meurent très rapidement : les milieux pour cellules souches, comme l'a dit Greg, sont excessivement riches en facteurs, vos cellules différenciées étant beaucoup plus nombreuses, elles "étoufferont" rapidement les autres.
     

  13. laylouchka

    Date d'inscription
    octobre 2008
    Messages
    37

    Re : séparation au ficoll

    je ne cultive pas longtemps mes cellules in vitro le but est de les transduire (pdt 5jours) via un retrovirus présent ds un surnageant virale qui contient un géne d'intéret; puis par la suite injecter ses cellules transduite à des souris qui in vivo en se diférenciant produiront la proteine de mon géne d'intéret, donc finallement je ne cherche pas a ce qu'elles gardent leur propriétés cellules souches
     


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