mutagénèse dirigée par double PCR - rôle de la Pfu ?

[Shirubi]

Bonjour,

Dans le cadre d'un TP de biologie moléculaire, nous avons réalisé une mutagénèse dirigée par double PCR. La Pfu polymérase a été utilisée pour la première PCR, et la Taq polymérase pour la seconde. Nous savons qu'il aurait été possible d'utiliser la Pfu pour seconde PCR, mais pas la Taq pour la première.

Pourquoi ???

Et si cela concerne le fait que la Pfu génère des extrémités franches, quel serait le lien avec les mutations apportées (par des amorces) lors de la première PCR ?

MERCI !

[jmbowie]

Bonjour,

Dans le cadre d'un TP de biologie moléculaire, nous avons réalisé une mutagénèse dirigée par double PCR. La Pfu polymérase a été utilisée pour la première PCR, et la Taq polymérase pour la seconde. Nous savons qu'il aurait été possible d'utiliser la Pfu pour seconde PCR, mais pas la Taq pour la première.

Pourquoi ???

Et si cela concerne le fait que la Pfu génère des extrémités franches, quel serait le lien avec les mutations apportées (par des amorces) lors de la première PCR ?

MERCI !

C'est plus lié au fait que les extrêmités ajoutées par la Taq peuvent perturber l'hybridation des produits de la 1ère PCR si bien que pendant l'assemblage, seule la matrice initiale (si il en reste) sera amplifié et non le produit d'assemblage entre les produits de la PCR Iaire alors que c'est celui-ci qui porte les mutations.
En pratique, une bonne Taq pour les 2 étapes fonctionne très bien (pour des petits produits de PCR du moins, < 1 kb)

[Flyingbike]

Je ne suis pas un pro en mutagenèse, mais il me parait aussi probable que ça soit une histoire de fidélité. On ne peut pas vraiment faire de mutagenèse avec une Taq qui fait pleind d'erreurs, du coup on utilise la Pfu qui est beaucoup beaucoup plus fidèle.

[jmbowie]

Je ne suis pas un pro en mutagenèse, mais il me parait aussi probable que ça soit une histoire de fidélité. On ne peut pas vraiment faire de mutagenèse avec une Taq qui fait pleind d'erreurs, du coup on utilise la Pfu qui est beaucoup beaucoup plus fidèle.

voilà sauf que sur les petits fragments, les Taq sont pas assez infidèles pour introduire fréquemment des erreurs et le bénéfice de la Pfu est d'autant plus faible

[Shirubi]

Merci beaucoup pour ces réponses !

[Shirubi]

(je pencherais particulièrement pour la première solution ; nos profs nous ayant dit que ce n'était ni une histoire de fidélité ni de vitesse d'élongation qu'ils attendaient)

[jmbowie]

La 2ème étape repose sur l'appariement par leurs extrémités 3' des fragments de PCR synthétisés pendant la 1ère étape. Si on a utilisé la Taq, en théorie, les A finaux ajoutés de chaque côté cassent les possibilités d'appariement entre ces molécules.
Voilà une bonne réponse académique je pense

[Shirubi]

C'est encore plus clair comme cela