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Retard sur gel

  1. Juju235

    Date d'inscription
    avril 2011
    Messages
    15

    Retard sur gel

    Bonjour,

    Est-ce que dans une expérience de retard sur gel on peux faire interagir l'ADN avec tout un extrait de protéines?? Si c'est le cas comment peut-on savoir après de quelles protéines il s'agit??

    Merci d'avance!


     


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  2. zimzum18

    Date d'inscription
    octobre 2006
    Âge
    25
    Messages
    280

    Re : Retard sur gel

    Je pense qu'il faudra faire des purifications de protéines par la suite tout simplement.
     

  3. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Chaville
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    29
    Messages
    2 481

    Re : Retard sur gel

    En fait on s'assure de la nature de la protéine d'intérêt en étudiant les effets d'un anticorps dirigé contre cette protéine. (dans le cas bien sûr où on a des candidats)
    En effet, si le retard qu'on observe est bien spécifique a la protéine d'intérêt, l'incubation avec un anticorps dirigé contre peut avoir deux effets : soit le retard est décalé vers le haut (supershift) du a la taille du complexe, soit le retard disparaît, a cause de l'encombrement produit par l'anticorps dans l'interaction avec la sonde.

    Si on ne connait pas la nature de ces protéines, c'est différent, et dans ce cas on peut utiliser d'autres techniques.
     

  4. Guillaume69

    Date d'inscription
    décembre 2006
    Localisation
    Paris
    Âge
    25
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    2 786

    Re : Retard sur gel

    Sinon, en absence d'anticorps, on peut aussi utiliser un extrait protéique qui ne possède pas la la protéine en question (Knock down, ou KO s'il est disponible), et observer une diminution / absence du retard.
     

  5. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Chaville
    Âge
    29
    Messages
    2 481

    Re : Retard sur gel

    C'est possible mais beaucoup moins rigoureux. Si tu n'as pas de shift en situation KO, comment dire que c'est du a l'absence de protéine ou a ses conséquences ?
     


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  6. bubux

    Date d'inscription
    avril 2009
    Localisation
    Strasbourg
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    34
    Messages
    18

    Re : Retard sur gel

    Salut,
    moi je n'ai pas utilisé de retard sur gel mais pas mal d'électrophorèse 1D et 2D et la technique que j'utilisais pour caractériser les protéines c'était la spectrométrie de masse. Ca me semble être la méthode de choix pour identifier une protéine ab initio.
    Bye
     

  7. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Chaville
    Âge
    29
    Messages
    2 481

    Re : Retard sur gel

    oui, mais pas du tout pour étudier une interaction ADN-protéine.
     

  8. bubux

    Date d'inscription
    avril 2009
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    34
    Messages
    18

    Re : Retard sur gel

    oui effectivement d'après ce que je comprends du gel retard la protéine n'est pas présente là ou l'ADN a migré, c'est donc foutu pour la spectro de masse
     

  9. gorben

    Date d'inscription
    avril 2005
    Localisation
    Bethesda, USA
    Âge
    35
    Messages
    1 109

    Re : Retard sur gel

    Sinon tu peux utiliser un biacore a la place du retard sur gel, et passer tes proteines fixees en spectro de masse. En plus ca te permet de calculer les constantes d'associations/dissociations
     

  10. Juju235

    Date d'inscription
    avril 2011
    Messages
    15

    Re : Retard sur gel

    Merci a tous pour vos réponses!

    Juste une autre petite question .
    Lors de la purification utilisant un tag....dans ce cas 6his. C'est quoi l'avantage ou désavantage de faire une purif en conditions dénaturantes par rapport à la native??
    Je vois pas à quoi ça sert de dénaturer :s

    Merci d'avance!
     

  11. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Chaville
    Âge
    29
    Messages
    2 481

    Re : Retard sur gel

    Il y a un rapport avec le gel shift ?
    sinon je dirais que c'est pour ne purifier que la protéine taguée et pas celles qui interagissent avec elle.
     

  12. bubux

    Date d'inscription
    avril 2009
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    34
    Messages
    18

    Re : Retard sur gel

    Salut,
    tu peux ne pas avoir le choix, si ta protéine est agrégée et le tag plus ou moins masqué, débobiner tout ça peut améliorer la purif.
    Le fait de dénaturer les protéases peut aussi être un avantage sur la stabilité d'un échantillon sensible.
    Le problême, et qui peut être insurmontable suivant la protéine, c'est la renaturation évidemment.
    a+
     


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