[Biochimie] Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau
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Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau



  1. #1
    invite52946466

    Question Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau


    ------

    Bonjour,
    Afin de montrer la localisation préférentielle d'une protéine (noyau / cyto) dans différentes conditions et avec différents mutant de cette protéine, je recherche un protocole permettant de séparer le cytoplasme de la fraction nucléaire. Puis, je visualiserai les niveaux de la protéines en WB. Je sais que cela se fait bien avec des kits notamment le kit Pierce Thermo NE-PER nuclear and cytoplasmic extract reagents. Mais ce genre de kit coûte très cher, ils se moquent de nous, il ne s'agit que de tampons. Je sais que ce type de manip peux de faire des protocole home made. Si une personne aurait la gentillesse de m'éclairer!
    D'avance merci!
    ++

    -----
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 19h44.

  2. #2
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    il y a la méthode tampon hypotonique/hypertonique (meme principe que NE-PER mais fait maison, mes collègues ont un meilleur rendement).

    Si tu me précises de quel matériel tu pars, je pourrais t'aider (cellules, tissus frais, congelés, etc)

  3. #3
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Bonjour,
    Merci pour ta réponse.
    Je pars de cellules Hela en monolayer....
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 19h44.

  4. #4
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    je peux te passer ce protocole qui marche bien :

    extraction de protéines nucléaires v1.pdf

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Ce protocole est très clair et très simple.
    C'est parfaitement ce que je cherchais et je vais m'empresser de tester cela dans les prochains jours...
    Un grand merci en tout cas.
    je te tiens au courant!
    ++
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 19h44.

  7. #6
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    héhé c'est moi qui l'ai fait.

    Je te précise quand même deux ou trois choses : le truc important, c'est d'arriver a l'étape ou tu mets le tampon hypotonique sur tes cellules sans les abimer. A ce moment, on fragilise la membrane plasmique qui libère le cytoplasme, et donc pour avoir une bonne séparation, il faut absolument réussir a décoller et a rincer les cellules sans trop les malmener.

    Si tu as des questions, tu peux me contacter.

  8. #7
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Ok ca marche!
    Encore merci!++
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 19h44.

  9. #8
    invite0f409d20

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    hello
    jai besoin d isoler les proteines cytoplasmiques de celles nucleaires est ce que votre protocole marche avec les cellules en suspension
    d avance merci bcp

  10. #9
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    oui il fonctionne très bien, il suffit a la premiere étape de centrifuger les cellules, d'aspirer le milieu et de procéder a la seconde étape.

  11. #10
    invite0f409d20

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    merci bien

  12. #11
    PassionBiochimie

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Bonjour, et merci pour ce protocole.

    Je l'ai suivi à la lettre, mais j'ai une contamination du noyau par des protéines cytoplasmique (GAPDH, actine) . Avez vous des pites pour régler ce problème ?

    merci bcp

  13. #12
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Hello

    Ça fait un bout de temps cette discussion

    Quel est votre matériel biologique de départ ?
    La vie trouve toujours un chemin

  14. #13
    PassionBiochimie

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    He oui, mais ces genres de sujet/probleme sont éternels ^^

    ce sont des cellules en culture, plus exactement des macrophages, adhérés en boite de petri

  15. #14
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Je n’ai pas de recul sur ces cellules.

    Globalement, soit votre lyse initiale n’est pas suffisante, soit vous ne lavez pas assez les noyaux.

    Vous pourriez essayer d’augmenter le temps d’incubation dans le tampon A, et/ou augmenter le temps d’agitation avec le Np40, et/ou augmenter le volume de lavage du culot de noyaux (voire laver deux fois)

    Ce genre d’optimisation est long et pas simple. Avez vous recherché si des protocoles plus spécifiques à vos cellules étaient disponibles ?
    La vie trouve toujours un chemin

  16. #15
    PassionBiochimie

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Merci beaucoup pour ces pistes,
    je pense que la lyse est suffisante puisque apres np40, les cellules observées aux microscopes sont "éclatées"
    J'ai cherché, mais pas évident à trouver.
    Si qqn sait ou il est possible de trouver ce genre de protocole plus spécifique, je suis preneuse !

  17. #16
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Vous pourriez montrer un exemple de wb Gapdh ? Pour avoir une idée de l’ampleur.
    Avez vous des protéines nucléaires dans la fraction cytosolique ?
    Il est généralement plus acceptable d’avoir des protéines cytosoliques dans la fraction nucléaire que des protéines nucléaires dans la fraction cytosolique. Mais ‘cela dépend de ce que vous cherchez. Le 100% de séparation n’est pas possible par des méthodes aussi «*simples*»

    Pour les protocoles, ce qui peut fonctionner c’est de poser la question sur researchgate ou protocol online, même si je crois que ce dernier a pris un coup dans l’aile depuis researchgate.
    La vie trouve toujours un chemin

  18. #17
    PassionBiochimie

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Ci-joint
    La GAPDH est aussi intense dans l’extrait nucléaire que cytoplasmique.
    Par contre, pas de protéines nucléaires dans l’extrait cytoplasmique (bon, une expo à 6 min on finit par voir TBP quand même dans l’extrait cyto)
    Moi je cherche à voir l’expression préférentielle d’un récepteur dans le noyau et pas sur la membrane cytoplasmique.
    Nom : Capture.PNG
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  19. #18
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Avez vous un autre marqueur ?

    La GAPDH peut transloquer dans le noyau dans certaines conditions : apoptose, stress, NO…
    Exemple : https://stke.sciencemag.org/content/1/27/ec247
    La vie trouve toujours un chemin

  20. #19
    PassionBiochimie

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Oui, je l’ai fait avec l’actine également, même échec !

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