ligation clonage

[mkh]

bonsoir,
s'il vous plaît qui peut m'expliquer la formule qui me permet de déterminer la quantité d'insert % vecteur pour effectuer une ligation ?c'est quoi la définition de mole of ends au niveau de manuel GST GENE FUSION SYSTEM PAGE 14?
merci
cordialement,
mkh

[Seron]

En gros pour une ligation simple (1 insert dans un plasmide) : c'est très classique et ça marche toujours

2 µl plasmide restreint (100-200 ng par exemple)
1 ligase T4
1 buffer ligase T4
6 insert restreint

En principe dans la formule de simple ligation (que tu peux trouver via google très facilement), tu tiens compte de la taille de l'insert, du plasmide et de leur quantité respectivement pour avoir le meilleur ratio insert/plasmide.

[mkh]

bonjour,
merci pour votre coopération, juste j'aimerais bien savoir quand est ce que je peux utiliser les ratios 1:1, 1:5, et 1:3 (insert/vecteur) comment je peux savoir si les bouts sont cohésifs ou pas sachant que j'ai utilisé ECOR I pour traiter mon plasmide et l'ADN ?
cordialement,
mkh

[mkh]

pardon les ratios correspondent à la proportion vecteur/insert

[Seron]

Si tu as utilisé EcoRI comme enzyme tu dois avoir ça :

Site EcoRI---------------------- Plasmide ----------------------- Site EcoRI (Simple ouverture du plasmide)

Site EcoRI ---- Insert ---- Site EcoRI

Pour savoir si les bouts sont cohésifs, regarde le site de restriction de l'enzyme, mais si tu as tout coupé avec EcoRI, tout peut se coller ensemble.

Par contre, tu risques d'avoir pas mal de faux positif avec ta technique car le plus simple pour la ligase que tu vas mettre, c'est de recoller le plasmide avec lui même (et donc ton insert sera pas dedans). Donc, ce qui faut que tu fasses, c'est d'essayer de mettre le plus d'insert possible dans ton tube de ligation (plus y a d'insert, plus la chance qu'il soit mis dans le plasmide est grande).

Ensuite tu dois faire une restriction diagnostique (EcoRI par exemple, tu dois pouvoir ressortir l'insert) pour savoir quels clones portent ton insert.

Cordialement,
Seron

[mkh]

c'est gentil de votre part merci

[mkh]

merci c'est gentil de votre part