Bonjour!
J'espère que quelqu'un pourra m'éclairer sur la méthode de pyroséquençage car malgré mes efforts et recherches, je ne comprends toujours pas la méthode. Je vais donc réécrire la "marche à suivre" donnée au cours.
1. On fragmente l'ADN, on le dénature et on ajoute l'amorce. --> OK
2. Amplification par PCR et liaison à des billes de 28 micromètres. --> On fait la PCR, c'est-à-dire qu'on utilise une polymérase qui va
Bonjour!
J'espère que quelqu'un pourra m'éclairer sur la méthode de pyroséquençage car malgré mes efforts et recherches, je ne comprends toujours pas la méthode. Je commence à désespérer Je vais donc réécrire la "marche à suivre" donnée au cours.
1. On fragmente l'ADN, on le dénature et on ajoute l'amorce. --> OK
2. Amplification par PCR et liaison à des billes de 28 micromètres. --> Là, je comprends plus.. La PCR est la réaction de polymérase en chaîne qui sert à amplifier le DNA. C'est-à-dire qu'après cette étape, comme au début on a de l'ADN dénaturé, on aura plusieurs copies simple brin? Quelle en est l'utilité?
3. Une bille par puits. Cette bille est couverte de copies d'un fragment d'ADN. --> OK, mais pourquoi plusieurs copies? Et dans chaque puits une séquence différente, c'est juste?
4. Le signal est lu pour chacun de puits. --> Je sais que lorsque la polymérase intègre un nucléotide, il y a formation de pyrophosphate qui est converti en ATP qui à son tour active la luciférine. Celle-ci génère de la lumière, donc le signe qui est mesuré. Je comprends que lorsqu'il y a un grand pic, plusieurs nucléotides ont été incorporés etc. Mais je ne comprends pas comment il est possible de savoir auquel de nucléotides correspond le signal-lumière...
De plus, comme il y a plusieurs copies de la séquence dans un puits, il y aura plusieurs signaux-lumières simultanés, non? Ou bien il y a seulement une seule polymérase?
Dans le pyroséquençage, on ajoute les nucléotides un par un (pas A, T, C et G en même temps) ducoup si tu as le brin :2. Amplification par PCR et liaison à des billes de 28 micromètres. --> Là, je comprends plus.. La PCR est la réaction de polymérase en chaîne qui sert à amplifier le DNA. C'est-à-dire qu'après cette étape, comme au début on a de l'ADN dénaturé, on aura plusieurs copies simple brin? Quelle en est l'utilité?
ATCGATCGATCGATCG
TAGCTA
et que tu envois un lot de "A", il ne se passera rien car la polymérase attend un "G" en face du "C" pour continuer la polymerisation
en revanche si tu lui met un "G" elle va polymériser tu vas libérer un pyrophosphate, dans le milieu, et celui ci va être detecté et entrainer un signal lumineux disant "ici on a incorporé une base" et sachant que tu as mis que des "G" tu sais qu'a cette position tu as un G et ensuite tu évacue et tu recommence a mettre des nucléotides un par un
en faisant ainsi tu sais exactement quelle base est incorporée à chaque position,
c'est a ca que sert la PCR, pas vraiment a amplifier dans ce cas,
même chose que ce que j'ai mis juste au dessus en fait, c'est parce que tu met tes nucléotides séparemment, pas ATCG en même temps ducoup si tu viens de lui ajouter du "A" et que tu as un signal lumineux, il ne peut avoir incorporé que du A puisqu'il n'avait rien d'autreMais je ne comprends pas comment il est possible de savoir auquel de nucléotides correspond le signal-lumière...
ce sont les mêmes séquences dans ton puit (excepté en cas de polymorphisme) ducoup si tu met pleins de A et ue tu as 100 séquences dans le puits, les 100 devrons l'incorporer et donc libérer 100 PPi ce qui correspond à une certaine intensité de signal lumineux, (disons "X" lux, ), comme il y a plusieurs copies de la séquence dans un puits, il y aura plusieurs signaux-lumières simultanés, non? Ou bien il y a seulement une seule polymérase?
si en ajoutant un nucleotide tu obtiens un signal de 2X lux ca voudra dire que ton intensité lumineuse est deux fois plus grande et donc que tu as 2 fois plus de pyrophosphate et donc que chaque séquence a assimilé deux Adenine a la suite
si en revanche tu obtiens une intensité de 0.5X lux cela signifie que tu as seulement la moitié des sequences qui ont incorporé le nucléotide (et donc possiblement un polymorphisme de séquence)
Dernière modification par Loupsio ; 04/02/2016 à 20h01.
Merci beaucoup! C'est beaucoup plus clair maintenant
