NGS (ex:illumina) : qu'est-ce qui limite la profondeur?

[tic-tic]

Bonjour à tous,

Je me posais cette petite question concernant la profondeur. Alors tout d'abord, puisque j'ai l'impression que profondeur et couverture sont souvent utilisées comme synonymes, je précise que pour moi, la profondeur fait référence au nombre de reads pour chaque position, tandis que la couverture fait référence au pourcentage de régions d'intérêt effectivement séquencées.

Ma question est, pour la technologie de séquençage par "pontage" de chez Illumina, par exemple, qu'est-ce qui limite le nombre de reads pour une position donnée? Au vu de mes connaissances, j'ai l'impression que, à condition d'avoir l'argent et le temps nécéssaire, rien ne limite théoriquement la profondeur, puisqu'à chaque run va être généré un read...donc il suffirait de répéter le processus autant de fois que nous le souhaitons.

J'aimerais donc savoir si c'est bien une simple question de choix (en fonction des moyens disponibles et de la profondeur nécéssaire pour l'étude en question) ou si il existe également une limite technique (nombre de run possibles limité par exemple).

Merci d'avance!
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[tic-tic]

ps : j'ai oublié entre temps que chaque position est retrouvée sur plusieurs clusters, puisque l'ADN a été fragmenté puis amplifié. Il y donc peut-être une confusion de ma part à ce niveau...

Donc si une position donnée sur le génome se retrouve séquencée sur plusieurs clusters de la puce (car présente sur plusieurs fragments), le nombre de reads fait il uniquement référence au nombre de clusters pour lesquels cette position est séquencée, ou est-ce que ça dépend également du nombre de run?

J'espère être clair...

[tic-tic]

Bon, je me suis fait un joli petit monologue, mais je crois que c'est réglé...

Je considère donc que la profondeur pour une position donnée dépend uniquement du nombre de clusters dans lesquels on va retrouver cette position. Et ca me parait cohérent avec le fait qu'il faut quasiment 1h pour chaque cycle (ajout d'une base), donc il me parait difficile de faire plus de 2 runs de 100 pb si on ne veut pas y passer plus de deux semaines...

[Tibosax]

Il n'y a rien à "considérer", la profondeur, qui que tu le veuilles ou non est bien un synonyme de couverture, a une définition bien précise. La profondeur c'est donc le nombre de reads non issus de duplicats de PCR qui couvrent une base donnée. On ne compte pas un duplicat de PCR comme un read de plus.

Tu devrais lire cette review : http://www.nature.com/nrg/journal/v1...l/nrg3642.html

Il y a bien des limites théoriques et techniques à la profondeur que l'on peut atteindre, en particulier la complexité du génome. Les régions de faible complexité sont très difficile voire impossibles à aligner pour des reads de petite taille, et il en résulte une chute dramatique de la profondeur après alignement. Pour contrer ce problème, il est nécessaire de séquencer des reads plus long, car la mapabilité augmente avec la longueur des reads.

[A voir en vidéo sur Futura]

[tic-tic]

Il n'y a rien à "considérer"

Oui, je me suis mal exprimé, bref, c'était pour dire que j'avais pigé mon erreur et que je comprends maintenant que blablabla...

Merci quand même pour la réponse.