Interaction cellule/virus

kenboi · 04/05/2006 - 15h08

Bonjour,
je vous expose mon problème en esperant que quelqu'un pourra m'aider...
J'aimerais verifier l'interation d'une glycoprotéine virale avec une protéine cellulaire. Pour cela j'incube le virus et la cellule, et je veux faire une IP suivit d'un western blot.
Mais qui me dit que le virus restera lié à la cellule lors des lavages et autres manips ? Y'a-t-il moyen de stabiliser les interactions ?

merci d'avance à ceux qui pourront me répondre.

You.

Vinc · 04/05/2006 - 17h28

Salut!
Ta glycoprotéine virale elle est sur la capside du virus (ou sur l'enveloppe)? C'est l'antirécepteur nescessaire à l'infection?

A+
Vinc

kenboi · 04/05/2006 - 17h51

Re,
Le virus c'est le HSV, la glycoprotéine est donc sur l'enveloppe.
Et la protéine cellulaire serait un recepteur de la gB et serait impliquée dans le processus de fusion

voila m'sieur.

Vinc · 04/05/2006 - 18h18

Si tu connais la séquence de ta glycoprot, tu peux utiliser d'autres moyens pour valider l'interaction comme une incubation de tes cellules sensibles avec des glycoprotéines virales solubles et tu regardes si ça inhibe l'infection lorsque tu rajoutes le virus...
Ou sinon tu construits une protéine de fusion GST/glycoprotéine virale et tu fais un pull down classique sur un un lysat membranaire des cellules sensibles pour voir si tu descends bien ton récepteur cellulaire..... T'as pas forcément besoin d'une interaction avec la cellule entière....non?

Vinc

kenboi · 04/05/2006 - 19h24

Ben en fait j'ai besoin du virus entier car je suppose qu'il y a des changements de conformation des glycoprotéines selon les interactions (un peu comme le VIH). Donc la glycoprotéine soluble ou couplé à GST, ca va pas...

C'est simple de construire une protéine de fusion ? Je peux envisager la construction avec le recpeteur cellulaire, mais je ne suis pas sure d'en connaitre assez sur lui...

Et qu'est ce qui n'allait pas dans la manip que je proposais..?

merci pour ton aide !

Tiscarab · 04/05/2006 - 19h53

Bonjour,
Il n'existe pas d'anticorps qui pourraient venir bloquer l'interaction?
Pour le fait de rester fixé, je pense que les lavages vont pas virer le virus, à condition de pas changer de force ionique.
Je comprend pas trop l'Ip puis le western pour montrer l'interaction virus-cellule?
Bon courrage

kenboi · 04/05/2006 - 20h52

Il existe un anticorps contre la glycoprotéine, mais on le sait deja que cette glycoprotéine est impliquée dans la fusion. Moi je m'interesse à l'interaction glycoprotéine/recpteur, et la fonction de cette interaction. Il me faudrait un anticorps contre le recepteur cellulaire, mais il n'existe pas...

Comment ca "a condition de ne pas changer de force ionique" ?

Et les IP et western sont là pour verifier une interaction glycoprotéine/receptor cellulaire.

thanks

Tiscarab · 04/05/2006 - 22h29

Ok pour l'Ac dommage
la force ionique peut modifier l'équiligre de l'intéraction récepteur-ligand. Donc rester pour les manip dans un tampon physio.
si t'as l'ADNc du récepteur cell, tu peux transfecter une cellule qui ne l'as pas et étudier la fixation du virus sur ces cellules mais c'est indirect.
sinon je vois pas trop

Toll · 05/05/2006 - 08h17

Bonjour,

euh, si je me rappelle bien le HSV (Herpes simplex virus) est un virus DNA enveloppé, non?.

donc faire une co-immunoprecipitation avec le virus entier, il faut oublier. car dans tu dois être en conditions stringentes pendant les lavages pour éviter au maximum les intéractions non-spé.... et je suis pas sur du tout que l'enveloppe virale résiste...

si j'ai bien compris ton probleme, tu cherches a savoir si l'intéraction entre la glycoprotéine virale et la protéine membranaire cellulaire (intéraction qui apparemment a déjà été montrée) sert à l'attachement du virus et /ou à l'entrée du virus dans la cellule?
j'ai bon?

si oui, peut etre serait-il bon que tu jete un oeil sur les publi concernant le rotavirus (bon c'est pas un virus enveloppé mais peut etre que l'approche peut etre bonne).

je sais que ce virus passe par plusieurs étapes d'attachement / fixation à la surface de la cellule hote avant de pénétrer dedans. de mémoire, il me semble qu'il y a l'intervention de plusieurs intégrines puis ensuite d'une protéine chaperone Hsc70.

regarde le boulot de l'équipe mexicaine d'Arias CF.

en espérant avoir aidé....

kenboi · 08/05/2006 - 10h55

Envoyé par Toll

euh, si je me rappelle bien le HSV (Herpes simplex virus) est un virus DNA enveloppé, non?.

Oui, exact !

Envoyé par Toll

si j'ai bien compris ton probleme, tu cherches a savoir si l'intéraction entre la glycoprotéine virale et la protéine membranaire cellulaire (intéraction qui apparemment a déjà été montrée) sert à l'attachement du virus et /ou à l'entrée du virus dans la cellule?
j'ai bon?

Non, pas exactement !
l'interaction n'est pas montrée ! Par l'IP et le wester, je voulais pecher la glycoprotéine virale et la protéine cellulaire pour montrer l'interaction.

Tu me dis qu'utiliser un virus entier c'est à oublier.
Mais dans mon idée, j'utilise un detergent, qui devrait lyser le tout, donc au final, je bosse plus vraiemnt sur un virus entier...
snif, tu crois vraiment que c'est impossible ?

MErci pour ton aide en tout cas

kenboi · 08/05/2006 - 10h56

Envoyé par Tiscarab

si t'as l'ADNc du récepteur cell, tu peux transfecter une cellule qui ne l'as pas et étudier la fixation du virus sur ces cellules mais c'est indirect.
sinon je vois pas trop

Hello,
Je pige pas bien..... Dans cette optique, on gère pas la glycoprotéine virale... donc je si mon virus interagit avec la cellule (ce qui est le cas) je ne sais pas par quelle molécule virale se fait l'interaction?

Svenn · 11/05/2006 - 22h18

Envoyé par kenboi

Bonjour,
je vous expose mon problème en esperant que quelqu'un pourra m'aider...
J'aimerais verifier l'interation d'une glycoprotéine virale avec une protéine cellulaire. Pour cela j'incube le virus et la cellule, et je veux faire une IP suivit d'un western blot.
Mais qui me dit que le virus restera lié à la cellule lors des lavages et autres manips ? Y'a-t-il moyen de stabiliser les interactions ?

merci d'avance à ceux qui pourront me répondre.

You.

J'arrive un peu tard, mais j'ai une excuse : j'étais pas inscrit avant.

SI ta protéine est bien un partenaire de gB et qu'elle est présente en quantité correcte à la surface des cellules, il n'y a aucune chance que le virus se décroche de ta cellule. Le virus ne porte pas une, mais plusieurs dizaines ou centaines de gB, dont un grand nombre vont se lier à cette protéine.
Imaginons un cas très défavorable : une affinité ridiculement faible de 10^(-2) entre gB et ce partenaire c'est vraiment très faible !), et 10 gB du bon coté du virus capables de former une liaison avec le partenaire. Dans ce cas, 'l'affinité du virus pour la cellule" sera de 10^(-2*10)= 10^(-20), c'est à dire une liaison extrêmement solide.

Par contre, il faut être sur que dans les conditions de pH, température, salinité, cette liaison est susceptible de se former si elle existe.
Et ensuite, il y a bien sur toute une série de témoins négatifs.

Bonne chance !

kenboi · 21/05/2006 - 15h18

Merci pour ton aide, elle est arrivée a temps !

ouabet · 12/09/2010 - 10h55

Salut,
ça date un peu, mais as tu finalement réussi à résoudre ton problème et par quelle technique/stratégie ? je te demande cela car j'ai une problématique similaire (comment identifier/mettre en évidence l'intéraction entre mon virus qui est cousin de l'HSV1 et la cellule hote). Merci