Problème d'amplification positive avec de l'eau en q-PCR!

[bedouille]

Bonjour,

J'ai une question à propos d'un résultat bizarre d'une q-PCR.
Elle a pour but de détecter la présence d'une maladie et sa variante dans des échantillons.
Les amorces on été designées en trouvant le peu de différences entre les deux séquences et ne peuvent pas trop être modifiées.
La PCR utilise aussi des sondes Taqman pour tester le 2 parties des gènes en même temps.

Le problème apparaît lorsque je teste un sujet sain, ou juste de l'eau. Il y a toujours une faible amplification de mes gènes! (les ct sont tardifs) et ce n'est pas du à des contamination exterieure.
Est ce que ca viendrait d'une dimérisation d'une des amorces avec la sonde? Combien faut il de nucléotides en commun pour qu'il y ai cette dimérisation?

Je ne peux pas faire de melt curve pour voir ca a cause des sondes taqman...

Autre soucis, dans certains cas, il n'y a pas du tout d'amplification du 1er gène chez un sujet malade alors qu'il y en a (une tardive) avec l'eau. C'est vraiment bizarre....
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[Flyingbike]

ce n'est pas du à des contamination exterieure.

vous avez l'air bien sûr.... comment pouvez vous l'affirmer ?

Est ce que ca viendrait d'une dimérisation d'une des amorces avec la sonde? Combien faut il de nucléotides en commun pour qu'il y ai cette dimérisation?

éventuellement, mais c'est plutôt difficile à prévoir

les ct sont tardifs

c'est à dire ?

Je ne peux pas faire de melt curve pour voir ca a cause des sondes taqman...

J'ai moins d'expérience en Taqman mais on ne peut pas voir le Tm des produits malgré la présence de la sonde ? En fonction de là ou elle est placée par rapport aux amorces ? (je me suis jamais posé la question....). Ou déposer sur gel ?

[bedouille]

Merci d'essayer de comprendre ce problème.
Il y a toujours eu cette petite amplification, depuis le début sur cette PCR c'est pour ca que je pense que ce n'est pas du à une contamination.
Et lorsque l'échantillon est vraiment positif, on voit l'amplification bien plus rapide (ct plus bas).

La sonde est placée entre mes deux amorces, mais non avec des sondes taqman il n'est pas possible de faire les melt cuve et voir les Tm. Ce qui me serait bien utile pour différencier une amplification de mon gene d'intert ou une dimérisaton des amorces.

[TanguyE]

Bonjour,

Si tu as du SYBR green au labo, tu peux enlever la sonde Taqman de ton mix et faire une qPCR avec du SYBR pour faire tes melting curves. Sinon, si mes souvenirs sont bons, Primer3 analyse tes primers et sondes pour voir la probabilité de dimérisation.

Ou déposer sur gel ?

Sinon ça

[A voir en vidéo sur Futura]

[bedouille]

ah oui merci, ca parait tt bete maintenant! je testerai le cp du sybrgreen.
Par contre je n'ai pas de quoi faire une pcr classique sur gel...

[TanguyE]

Euuh je suis pas sur de suivre. Si tu peux faire une qPCR, tu peux faire une PCR normale. D'autant que tu veux voir une amplification sur tes contrôles négatifs donc pas besoin de template. Et ce que suggère Flyingbike c'est de déposer sur gel une de tes réactions de qPCR avec un de tes contrôles négatifs, pas besoin de refaire une PCR.

[bedouille]

Oui, nous n'avons pas de gel ou de geldoc... ce n'est pas un labo de recherche. Merci en tt cas pour tes conseils.