Déchiffrage d'une carte de plasmide

[nicozzie]

Bonjour a tous,

Je tente de dechiffrer la carte d'un plasmide,
c'est a dire comprendre les fonctions des differentes parties du plasmide.
Pour info il s'agit de ce plasmide : pcdna3.1+.
Je bute en particuler sur le Signal de polyadénylation du SV40.
Quel est son role ?

Merci d'avance.
Amities d'Australie

[Vinc]

Salut!
Les 2 lignes au dessus du plasmide correspondent aux différents sites de restrictions (éventuellement pour cloner une séquence dans ces poly-linker).
La séquence de polyadénylation BGH est située juste derrière les sites de restriction ce qui permettra à ta séquence insérée de recevoir une queue polyA et tu obtiendra un ARNm fonctionnel (=traductible en protéine).
Juste avant les sites de restriction tu as bien sûr un promoteur pour initier la transcription de ta séquence (Pcmv). Les séquences Ori sont les origines de réplication du plasmide.
Tu as enfin deux cassettes de résistance, une à l'ampicilline et l'autre à la néomycine, pour les sélections.
La séquence de polyA du SV40 est peut-être nescessaire pour que la polyadénylation ait bien lieu dans certains organismes, la première séquence BGH reste peut-être spécifique, mais ça n'est qu'une supposition.
A+
Vinc

[nicozzie]

Bonjour,
et merci pour cette reponse complete.

A present je me demande juste comment les plasmides recombines vont pouvoir etre selectionnes :
en effet, j'ai bien deux genes de resistance a des antibiotiques, mais mon polylinker n'est pas sur un de ces genes, comme c'est habituellement le cas.
Quelqu'un a-t-il une idee ?

Merci,
Nico.

[Vinc]

Salut!
Ce n'est pas très grâve, ca veut juste dire que tu considères que chaque clone obtenu sur milieu sélectif aura un plasmide avec insert (ce qui n'est évidemment pas forcément le cas). Donc à toi ensuite de valider chaque clone par PCR en amplifiant le polylinker et en sélectionnant les clones qui ont une bande de la taille de ton insert (plus les borne du ploy linker en fonction des sites d'hybridation des primers). Tu fais des répliques sur colonie ou alors tu les numérotes précisemment de manière à savoir après la PCR quel clone possède l'insert et quel clone ne l'a pas.

A+
Vinc

[piwi]

personnellement bonne vielle methode:
piquer une colonie
tremper le cure dent (qui etait propre) dans le tube avec le mix pcr puis le laisser dans un tube avec du LB + antibio de selection en vu d'une miniprep.
faire la pcr avec un hotstart de 15 mins à 94° pour faire exploser les bactos.
Je fais fais ca sur 15 clones et en principe, j'en ai toujours un de bon au final.

Je ne poursuis le clonage qu'avec avec les bons clones.

Cordialement,
piwi

[nicozzie]

Bonjour et merci pour ces precisions,

j'en ai encore une a vous demander ( c'est un peu question pour un champion ici )
Quelle est la difference entre les promoteurs "pUC" et "f1 ori" ??

[mantOs]

Envoyé par nicozzie

Quelle est la difference entre les promoteurs "pUC" et "f1 ori" ??

Salut, à moins que je me trompe mais les cassettes "pUC ori" et "f1 ori" ne sont pas des promoteurs mais des origines de replication.
Ton promoteur ici c'est celui du virus CMV .

[Fabian]

Envoyé par mantOs

Salut, à moins que je me trompe mais les cassettes "pUC ori" et "f1 ori" ne sont pas des promoteurs mais des origines de replication.
Ton promoteur ici c'est celui du virus CMV .

Bonjour,

En effet, pUC ori et f1 ori sont bien des origines de réplication et non des promoteurs. pUC ori est une origine de réplication procaryote tandis que f1 ori est l'origine de réplication spécifique au phage M13 monobrin. Ce dernier est notamment utilisé pour faire du séquençage ou de la mutagenèse dirigée.

Cordialement.