(L2) PCR pour la détection de rétrovirus.

[inviteeb0c1f3f]

Bonjour!
Je viens de finir un exercice, que j ai résolu, mais je ne crois pas tout bien comprendre....
Ils me donnent la séquence ADN d'un rétrovirus, et me demandent "le protocole utilisé pour mettre au point une technique qui permette de détecter par PCR la présence de ce rétrovirus à partir d'échantillons humain, en amplifiant un fragment du génome d'environ 250 nucléotides"

-sachant qu'il s'agit d un rétrovirus, on peut faire une transcriptase inverse ARN->ADNc

-à partir des l'ADNc faire une PCR...

C'est là que le bât blesse...je ne vois pas en quoi faire une PCR (à part le fait que ça soit le titre de l'exo) peut aider à trouver un virus? ça doit etre simple mais je vois pas...

De plus, que veulent-ils dire "en amplifiant un fragment du génome d'environ 250 nucléotides"?

merci de votre réponse!
-----

[jerome.lebloch]

Il ont du te donner une séquence d'ARN et pas d'ADN du retrovirus.

Pour le mettre en évidence, tu peux effectivement faire une RT-PCR.

RT : reverse trasncriptase : tu transforme ton ARN en ADNc

PCR : tu amplifie une partie de ton ADNc (ici un amplicon de 250 nucléotides) et tu le met en évidence pas fluorescence. Pour amplifier tu as besoin d'amorces (petit bout d'ADN simple brin) qui sont spécifique de ta séquence d'ADNc, donc spécifique de ton virus. Donc si avec tes amorces tu arrive à amplifier qqchose, c'est que ton virus est présent. De plus l'amplificationva etre dépendante de la quantité de d'ADNc présent, donc de virus. Tu peux donc avoir une idée de la quantité de virus présent...

[inviteeb0c1f3f]

ok, merci beaucoup je crois qu'en regardant ta réponse et en me laissant un peu de temps, j ai réussis à comprendre, c'est le mot amplification qui me posait soucis. Bref, pour être sûre que j'ai bien compris:

si mon ARN est "AUC"
mon ADNc est "TAG"
mon amorce est "ATC" ?

[invite495db432]

ok, merci beaucoup je crois qu'en regardant ta réponse et en me laissant un peu de temps, j ai réussis à comprendre, c'est le mot amplification qui me posait soucis. Bref, pour être sûre que j'ai bien compris:

si mon ARN est "AUC"
mon ADNc est "TAG"
mon amorce est "ATC" ?

Oui c'est ça, mais ton ADNc va être bi cathénaire en réalité, il faut une amorce pour la séquence antisens aussi
Il faut savoir qu'une amorce en PCR fait idéalement environ 20 bases. Donc l'objectif est de "desaïgner" une paire d'amorce de 20 paires de bases qui encadre ta séquence spécifique de 250pdb. (Une amorce sens, une amorce anti-sens)
Une fois "desaïgnées" tes amorces doivent être comparé à une base de données pour en vérifier la spécificité (Histoire de ne pas amplifier de l'ADN de poule ou de moisissure, ou n'importe quoi d'autre)

Aussi, pour compléter la réponse de jerome.lebloch, on peut faire une PCR quantitative en utilisant soit une amorce interne fluorescente qui brille lorsqu'elle est fixé sur l'ADN monocathénaire, type sonde TaqMan, soit un agent inrecalant type SYBR Green, qui ne brille que lorsqu'il est intercalé dans l'ADN double brin... Le mesure de la cinétique de la fluorescence permet de quantifier l'ADNc amplifié par PCR. Ces techniques de PCR quantitative donnent ce qui est appelé par le milieu médical la "charge virale" (peut-être en avez vous déjà entendu parlé)

[A voir en vidéo sur Futura]