Clonage d adn dans un plasmide

[invite0c2bc4db]

bonjour tout le monde

j ai une petite question qui vient d un exercice et que je n arrive pas a resoudre (biensûr j ai pas le corrigé!!!!!!!!)

voilà on a cloné de l adn g dans un plasmide pbr322 et on voudrait savoir comment le récupérer???

en fait comment fait on pour séparé le fragments clonés de l adn plasmidique???
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[invitef93eb190]

avec des enzymes de restriction ....
les mêmes que celles utilisées pour l'intégration de l'ADN dans le plasmide

[invite0c2bc4db]

merci merci
mais comment on sait lequel est lequel???
on fait une hbridation moléculaire???du coup il faut connaître la séquence de l adn a cloner??????

mais après comment sort-on cet adn de la cellule, en fait je comprends pas comment on récupère le fragment cloné???

si on lyse la bactérie, on aura deux types d adn l adn plasmidique l adn genomique et l adn du fragment comment faire pour ne recuperer que l adn du fragment?????

c est pas clair dans ma tête
lol
merci

[invitef93eb190]

En fait, comme tu dis, il faut faire une lyse des cellules.
Puis tu digères les ADN par les bonnes enzymes de restriction.
Enfin tu réalises une électrophorèse puis tu récupères les bandes correspondantes à ton fragment d'ADN (si tu connais la taille du fragment que tu clones).

Si tu ne connais pas la taille du fragment, ou si tu veux une meilleure purification, il existe des protocoles de purification des ADN plasmidiques : tu récupères uniquement l'ADN plasmidique.
Puis digestion, et enfin électrophorèse.

Je sais pas si c'est plus clair comme ça.

PS : je peux te donner plus d'infos sur la purification des plasmides (après avoir retrouvé le protocole de mes TP.....) si tu veux

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0c2bc4db]

je te remercie c est parfait

maintenant c est bien plus claire dans ma tête et je te remercie mille fois........;

[invitebd27bf8a]

Bonjour à tous,

Ma réflexion se porte sur le choix de l'enzyme de restriction (ER) (en rapport avec exercice en pièce jointe).
Selon moi, le choix de l'ER se porte:
- sur la fréquence de coupure
- sur obtention d'un site de restriction compatible avec le plasmide
- le faite que le site soit présent en un seul exemplaire sur le plasmide
- et que ce site se situe uniquement sur l'une des régions de résistance (Amp^R ou Tet^R)

D'office, j'éliminerai l'ER:
- AfeI (car présent en 2 exemplaires)
- EcoRI (car situé en dehors des régions de résistance)
- CaiI, SbfI et SwaI (car probabilité de coupure trop faible: 1 site tous les 262kpb pour CaiI et 1 site tous les 65,5kpb pour SbfI et SwaI)

Je sais que l'on peut utiliser plusieurs ER tant que leur site est compatible. Mais maintenant, comment dois-je procéder pour le(s) choisir sachant que je ne connais pas la taille de l'ADN génomique ?

Merci d'avance l'aide!

[piwi]

Vous avez oublié de joindre la carte de restriction.

Question alternative: Est ce que l'on est vraiment sur un niveau pré bac? Ca risque de faire peur aux enfants là!

[invitebd27bf8a]

L'exercice correspondant à mon post est un pièce jointe.

[invitebd27bf8a]

Question alternative: Est ce que l'on est vraiment sur un niveau pré bac? Ca risque de faire peur aux enfants là!

Oups! En faite c'est du niveau L2... Désolée.

[invitebd27bf8a]

Je vais reposter dans la bonne catégorie.