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[Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

  1. Vinc

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    février 2004
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    [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Salut à tous !
    Bon pour changer un peu de la signalisation cellulaire et de la cancéro, je vous ai cette fois ci préparé un petit "jeu" de génie génétique qu va nous permettre de comprendre (ou de réviser ) le principe de production d’une lignée de souris KO (dans les grandes lignes).
    Comme d’hab, il y a quelques questions peut-être un peu ardues mais bon…. Les 2 parties sont indépendantes (la première se faisant très rapidement et facilement car c’est du cours bête et méchant) et les questions sont en italique.

    I°) Questions de cours : généralité sur les manipulations génétiques

    1) Qu’est ce qu’une transformation en génie génétique ? Et une transfection ?

    2) Le système LacZ est souvent utilisé en tant que système rapporteur en biologie moléculaire.
    Décrivez le principe de fonctionnement d’un système rapporteur et plus précisément celui du système LacZ. En connaisez vous d’autres ?

    II°) Syndrome de Coffin-Lowry et lignée KO

    Le Syndrome de Coffin Lowry (CLS) est dû à des mutations dans le gène RSK2, qui code pour une Serine/Thréonine kinase, notamment impliquée dans le développement cérébral et osseux.
    Afin d’étudier la relation génotype/phénotype chez les patients atteints du CLS, une équipe a décidé de construire une lignée de souris KO pour le gène RSK2.

    1) Rappelez rapidement ce qu’est une lignée KO ?

    2) Le gène RSK2 est divisé en 22 éxons. Les chercheurs ont donc réalisé la construction génétique suivante, « in vitro » :

    (shéma en bas du message)

    Sur quel processus génétique classique est basée l’élaboration de cette lignée KO ? A quoi sert la cassette Néo et que doit –elle contenir outre la séquence codant pour la résistance à la Néomycine ?
    A quoi sert la séquence codant pour la thymidine kinase et pourquoi les chercheurs l’ont-ils placé juste après l’exon 22 ?


    3) La construction présentée dans la question précédente a été transfectée dans des cellules ES murines. Ces cellules ont ensuite été sélectionnées grâce à l’ajout, dans le milieu, de gancyclovir et d’une autre molécule.
    Qu’est ce qu’une cellule ES ? D’après la question II°)2), quelle est l’autre molécule introduite dans le milieu ? Qu’est ce que le gancyclovir et quel est son mode d’action ?

    4) Les cellules sélectionnées sont ensuite introduites par micro injection dans un blastocyste de souris, puis les embryons sont réimplantés dans des mères porteuses.
    Quelle va être la nature génétique des souriceaux qui vont naître ?

    5) Les chercheurs ont ensuite croisés ces souriceaux pour obtenir des individus F1.
    Sachant que les F1 obtenues sont RSK2 +/-, que peut-on dire quant à la colonisation des territoires embryonnaires par les cellules ES RSK2 +/- transfectées, chez les parents de ces F1 ?

    6) L’équipe a finalement réussit à « produire » des individus homozygotes femelles RSK2 -/- par croisement des F1.
    Sachant que le gène RSK2 est situé sur le chromosome X, était il nécessaire de refaire un croisement pour obtenir des homozygotes chez les individus mâles ?

    7) L’étude du rôle physiologique de RSK2 « in vivo » chez ces souris KO a été possible car le gène RSK2 n’est pas un « gène essentiel ».
    Qu’est ce qu’un « gène essentiel » ? Que se serait-il passé si RSK2 avait été un gène essentiel ? Dans ce dernier cas, quelle stratégie auriez vous envisagé pour obtenir des individus adultes mutés pour un gène essentiel ?


    Voili voilou !
    Bon courage à tous, ce n’est pas très difficile !

    A+
    Vinc

    -----

    Images attachées
    Dernière modification par Vinc ; 12/04/2006 à 09h35.
    Primum non nocere.
     


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  2. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
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    AP-HP
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    3 099

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Ben alors? Personne n'est inspiré???
    Aller on se lance!!!!

    Vinc
    Primum non nocere.
     

  3. Dr. NucleYous

    Date d'inscription
    octobre 2006
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    178

    Question Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    salut Vinc.
    je suis un élève de 1ère S. Pourriez vous me donner quelques exercices de révison en ce qui concerne les protéines les enzymes et le code génétique. Je suis désolé de ne pas pouvoir résoudre ton exercice car c'est compliqué pour moi.
    merci d'avance.
     

  4. mantOs

    Date d'inscription
    mai 2006
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    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    I°) Questions de cours : généralité sur les manipulations génétiques

    1) Qu’est ce qu’une transformation en génie génétique ? Et une transfection ?

    2) Le système LacZ est souvent utilisé en tant que système rapporteur en biologie moléculaire.
    Décrivez le principe de fonctionnement d’un système rapporteur et plus précisément celui du système LacZ. En connaisez vous d’autres ?

    1)
    Une transformation est l'introduction d'un vecteur contenant un ADN étranger dans une cellule procaryote .

    Une transfection est le même processus mais chez les eurcaryotes.

    2)
    Un gène rapporteur est un gène-témoin codant pour une protéine d’activité connue et détectable, utilisé pour étudier l’activité d’autres gènes.
    Dans le cas du système LAC z le gène-témoin est le gène codant pour la B-galactosidase responsable de l'hydrolyse du lactose et son activité enzymatique est mesurable ( variation de pH du milieu ) .
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.
     

  5. mantOs

    Date d'inscription
    mai 2006
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    910

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    II°) Syndrome de Coffin-Lowry et lignée KO

    Le Syndrome de Coffin Lowry (CLS) est dû à des mutations dans le gène RSK2, qui code pour une Serine/Thréonine kinase, notamment impliquée dans le développement cérébral et osseux.
    Afin d’étudier la relation génotype/phénotype chez les patients atteints du CLS, une équipe a décidé de construire une lignée de souris KO pour le gène RSK2.

    1) Rappelez rapidement ce qu’est une lignée KO ?
    Une lignée KO est une lignée dans laquelle les 2 copies d'un gène cible sont invalidées

    2) Le gène RSK2 est divisé en 22 éxons. Les chercheurs ont donc réalisé la construction génétique suivante, « in vitro » :

    (shéma en bas du message)

    Sur quel processus génétique classique est basée l’élaboration de cette lignée KO ?
    Sur le principe de recombinaisons homologues
    A quoi sert la cassette Néo et que doit –elle contenir outre la séquence codant pour la résistance à la Néomycine ?
    La cassette néo permet la selection des clones ayant recombinés avec la construction par traitement a la néomycine.
    Pour la 2eme partie de la question je vois pas.


    A quoi sert la séquence codant pour la thymidine kinase et pourquoi les chercheurs l’ont-ils placé juste après l’exon 22 ?
    La cassette TK sert de marqueur afin que la recombinaison soit bien ciblée .
    Les clones ayant recombiné avec la cassette néo et Tk seront non selectionnés par traitement tuant les clones TK+ . (Cf schéma proportions exon/néo non respectées)


    La cassette est placée après le dernier exon afin de limiter les recombinaisons non ciblées contenant TK . ( besoin d'eclaircir )

    3) La construction présentée dans la question précédente a été transfectée dans des cellules ES murines. Ces cellules ont ensuite été sélectionnées grâce à l’ajout, dans le milieu, de gancyclovir et d’une autre molécule.
    Qu’est ce qu’une cellule ES ?
    Une cellule ES est une cellule souche embryonnaire (Embryonic Stem Cell)
    D’après la question II°)2), quelle est l’autre molécule introduite dans le milieu ?
    La néomycine
    Qu’est ce que le gancyclovir et quel est son mode d’action ?
    Le gancyclovir est un antiviral et est transformé en gancyclovir triphosphate par la thymidine kinase induisant la mort de la cellule.

    4) Les cellules sélectionnées sont ensuite introduites par micro injection dans un blastocyste de souris, puis les embryons sont réimplantés dans des mères porteuses.
    Quelle va être la nature génétique des souriceaux qui vont naître ?
    Les souriceaux seront des souriceaux chimères.


    Je ferai la suite plus tard si il m'en vient le courage
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.
     


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  6. Pioute59

    Date d'inscription
    mai 2006
    Localisation
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    8

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Bonsoir,

    Je trouve ce sujet très intéressant ! (ayant des difficultés dans la matière)
    Pourriez vous finir le sujet ainsi que m'expliquer davantage le role de la TK et la recombinaison homologue svp !
    J'aimerais pouvoir recopier tout ce sujet avant mon exam si possible
    merci d'avance
    Tite Pioute ^^
     

  7. mantOs

    Date d'inscription
    mai 2006
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    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Pour la thymidine kinase va phosphoryler le ganglycovir et induire la mort cellulaire.

    La recombinaison homolgue; rien de plus simple c'est une hybridation de base conventionnelle .

    La séquence insérée présente des complémentarités avec la séquence visée et par le processus naturel de recombinaison on aura insertion de la séquence d'interet à l'endroit cible ( ou pas , CF les test de selection ) .
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.
     

  8. asmahan

    Date d'inscription
    janvier 2007
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    37
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    17

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Citation Envoyé par mantOs Voir le message
    1)
    Une transformation est l'introduction d'un vecteur contenant un ADN étranger dans une cellule procaryote .

    Une transfection est le même processus mais chez les eurcaryotes.

    2)
    Un gène rapporteur est un gène-témoin codant pour une protéine d’activité connue et détectable, utilisé pour étudier l’activité d’autres gènes.
    Dans le cas du système LAC z le gène-témoin est le gène codant pour la B-galactosidase responsable de l'hydrolyse du lactose et son activité enzymatique est mesurable ( variation de pH du milieu ) .
    salut, je suis désolée mais je t'arrete tout de suite ou arretez moi plutot si je me trompe ....mais la transformation ne se fait pas forcément par un vecteur sauf in vitro et encore!! que ca soit pour une cellule procaryote ou eucaryote (injection d'ADN nu par exemple) ....(et pour les procaryotes; je t'envoie vers l'expérience de Griffith et de Macleod et al)
    pour la transfection: il s'agit d'un transfert génétique des cellules eucaryotes par des virus..........chez les bactéries on l'appelle ca transduction et c'est fait par les phages (virus des bactéries)

    vraiment corrigez moi si je me trompe
    Le monde est une comédie pour ceux qui pensent, une tragédie pour ceux qui sentent
     

  9. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
    Localisation
    AP-HP
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    3 099

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Salut!
    Citation Envoyé par asmahan Voir le message
    mais la transformation ne se fait pas forcément par un vecteur sauf in vitro et encore!! que ca soit pour une cellule procaryote ou eucaryote (injection d'ADN nu par exemple) ....(et pour les procaryotes; je t'envoie vers l'expérience de Griffith et de Macleod et al)
    pour la transfection: il s'agit d'un transfert génétique des cellules eucaryotes par des virus..........chez les bactéries on l'appelle ca transduction et c'est fait par les phages (virus des bactéries)
    Bon alors....
    A mon sens, on parle de transformation uniquement pour les procaryotes mais la tendance actuelle (en tout cas depuis quelques années) est d'utiliser le terme "transformation" pour les procaryotes ET pour les eucaryotes. Pour la définition : je dirai simplement que c'est l'introduction d'un acide nucléique exogène (et quand je dis éxogène je ne veux pas dire que ca ne comprend pas l'insertion d'un gène déjà présent dans le génome, par exemple pour une surexpression, mais simplement que l' A.N vient de l'"extérieur").

    Pour la transfection, toujours selon moi, c'est le pendant de la transformation, mais pour les aucaryotes et l'origine de l'utilisation du mot vient bien, il me semble, des virus. Sinon le terme transduction (en plus de son sen signalisation cellulaire) est effectivement employé pour le stransfert de gènes entre bactéries via les phages.

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.
     

  10. descmarc

    Date d'inscription
    mai 2007
    Âge
    31
    Messages
    286

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Salut

    Tout d'abord cette rubique est géniale, les exos sont vaiment de qualités je trouve.

    Alors je vais moi aussi tenter de répondre à cette exo.
    I
    1)
    Transformation: Aqcuisition ( plus ou moins spécifique ) chez une bactérie (plus largement un procaryote) d'un ADN exogéne nu. En clair un morceaux d'ADN tout bête qui se ballade.lol

    rq: Le "nu " est pour moi important car si l'ADN exogéne est "donné"par un phage c'est de la transduction ou par une autre bactérie via un plasmide "sexuel" c'est de la conjugaison...
    Soyons précis sur ces définition sinon c'est le bordel..lol

    Transfection: Acquisition par une cellule eucaryote d'un ADN exogéne nu ( par micro-injection.....). Si l'ADN est transmis par un virus c'est pour moi de l'infection!!

    2)
    Le but d'un systéme raporteur est d'étudier l'activitée d'un promoteur. Pour cela on le couple par génie génétique à un géne raporteur, ici lacZ.
    Un géne raporteur doit avoir pour propriétée de coder un produit facilement détéctable et si possible quantifiable.
    Ici on révélera l'activiter B-galactosidase par ajout dans le milieu de X-gal.

    D'autre systéme peuvent étre créer avec la GFP, la luciférase...

    II
    1)
    Une ligné KO est une lignée que l'on à rendu par croisement homozygote pour un géne de maniére à ce que le géne considéré soit mutant et éteint.
    En fait mantOs la bien résumé.lol

    2)
    Je ne comprenais pas la question jusqu'à ce que je lise la reponse de mantOs.
    Je dis comme lui.lol

    La cassette neo sert à séléctionner les clones neo résistants donc les clones ayant recombinées ( sa mantOs la très bien expliqué.lol) Par contre MantOs tu as du oublier que la néomycine n'apparait pas comme sa il faut ajouter un promoteur à sa sequence......

    La thymidine kinase sert exactement à ce qu'a dit mantOs (encore lui.lol).
    Je pense que la TK est placé juste aprés l'exon 22 pour augmenter la spécificité de recombinaison.
    Je m'explique, plus la séquence TK est proche exon 22 plus la probabilité d'avoir un double crossing-over juste au sequence bordant néo est faible! cependant lorsque cela arrive on peut supposer que cette événement de recombinaison a été très spécifique.
    On séléctione donc les clones et on peut suposer avoir des clones ayant recombinés de maniére très spécifique!!

    3)
    Cellule ES= Embryonic Stem Cell= cellule souche embryonnaire Sa particularité est d'étre totipotente c'est d'ailleurs pour cela qu'elle est interresante!lol

    Il faut introduire de la neomycine comme la dit mantOs ( mais sa je le savais.lol)
    Pour le gancylivor je l'aurais su aussi mais en regardant dans mon cour en tout cas mantOs encore une fois la très bien expliqué.

    4)
    Les souriceaux seront des chiméres, ils posséderont deux génotypes différents.

    5)Les cellules transféctées ont contribuées au devellopement de différent types celllaires dont la lignée germinale.

    6)
    Alors pour celle là je dirais non, on doit avoir en F1 des mals RSK2- et d'autre RSK2+. Il suffit de selectionner les RSK2-
    Mais je sais pas pourquoi sa à l'air trop facile!!!bizar..lol

    7)
    Un géne essentiel...alors je ne suis plus très sur mais je dirais que ces géne sont des génes dont le defaut d'activité est létal lors du dévellopement embryonnaire (si on se place au niveau du foetus)
    Si on se place au niveau cellulaire on pourrait dire qu'un géne essentiel est un géne dont le défault d'activité et létal pour la cellule lors du cycle cellulaire..

    Si je suis mon raisonement il est donc difficile d'étudier des homzygotes KO pour ces génes ( quoi que par autopsie de foetus on peut très bien étudier certaine choses.Si on se place dans le cas 1)

    Donc si RSK2 avait été un géne essentiel nous naurions pas pu créer de lignée K-o!!!

    Pour la stratégie à adopter je penche pour la mutation conditionnelle.
    Mutation conditionnelle= mutation qui s'exprime sous certaines conditions ( température, salinité...)
    on peut tenter de screener les mutations pour RSK2 et voir si certaines peuvent étre conditionnelles ou tenter de coller à la sequence du géne une sequence codant une molécule qui permetrer une activiter éfficace de la proteine RSK2 en condition normale et une activité inhibé dans une condition a définir (température, ajout dans l'eau de boisson d'un antibiotique.....)


    Voilà, exo comme je disais très interressant

    j'éspére avoir une corection.
    Je rentre en M1 de génétique à la rentré c'est donc impécable c'est exo pour moi.
    j'éspére que d'autre suivront...

    Merci a vinc,piwi et mantOs


    PS: Je sais, je sais..... l'orthographe.lol


    marc
     

  11. descmarc

    Date d'inscription
    mai 2007
    Âge
    31
    Messages
    286

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    SVP fermer pas l'exo sur la voie de transuction, il est fait mais là j'ai plus le courage de répondre!!lol
    demain

    merki beacoup

    marc
     

  12. salyange

    Date d'inscription
    mai 2009
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    32
    Messages
    1

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    slt ,stp d'ou tu as ramené cet exercice!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
     

  13. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
    Localisation
    AP-HP
    Messages
    3 099

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Citation Envoyé par salyange Voir le message
    slt ,stp d'ou tu as ramené cet exercice!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
    Je l'ai inventé.

    Merci de me dire si vous souhaitez une correction!

    V.
    Primum non nocere.
     

  14. L3bioch

    Date d'inscription
    décembre 2011
    Messages
    1

    Re : [Bio] [L2/M1] Génie génétique et souris KO.

    Bonjour,
    Puis-je avoir la correction de votre exo? merci d'avance
    Serait -il possible d'accéder à d'autres exos de ce types? g un devoir bientôt!
    Bonne journée!
     


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