Immunoblot

[invite2232fa85]

Coucou tout le monde,

j'aimerais une confirmation :

est ce que le southern blot est bien une électrophorèse faite avec des fragments d'ADN

le northern blot avec des ARN

et le western-blot avec des protéines ??

merci parce que je m'embrouille un peu....

[invite71f23525]

C'est tout à fait ça. Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité). C'est donc une variante du SDS-PAGE, car c'est toujours une électrophorèse de protéines sauf qu'on n'est pas en conditions dénaturantes et qu'on détecte avec un anticorps. Pour Northern et Southern, je suppose que tu sais.

Greg

[invitea0443c8c]

Salut!

Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité).

Non pas forcément! Tu peux très bien utiliser un anticorps secondaire qui détecte le fc de ton anticorps primaire, c'est d'ailleurs ce qui ets majoritairement utilisé.

C'est donc une variante du SDS-PAGE, car c'est toujours une électrophorèse de protéines sauf qu'on n'est pas en conditions dénaturantes et qu'on détecte avec un anticorps.

????? Je ne comprends pas du tout ce que tu veux dire. Que tu détectes avecun anticorps ou deux tu peux te placer en conditions dénaturantes.
Le SDS PAGE ne donne pas d'indication sur la méthode de détection.

A+
Vinc

[invite71f23525]

Oui c'est vrai que je me suis mal exprimé. Je voulais dire que l'étape précedent un western est un SDS-PAGE, sauf qu'on ne se place pas obligatoirement en conditions dénaturantes (donc dans ce cas, il vaut mieux utiliser l'expression de "gel migration" que SDS-PAGE). Mais vu que je ne voulais pas embrouiller biscotte91, j'ai pris un raccourci pas tout à fait exact.

Et en effet l'utilisation d'un anticorps secondaire reconnaissant l'anticorps primaire est désormais utilisé la plupart du temps (pour ne pas dire tout le temps ), mais là encore j'ai voulu simplifier pour que ce soit compréhensible, en introduisant en même temps la notion de détection par anticorps couplé à une activité physique, chimique ou biochimique détectable .

Cordialement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2a651650]

bonjour,

quand on parle de western blot, par defaut on parle de la technique en condition denaturante ( avec SDS et beta mercapto ou DTT).

si on est pas en conditions denaturantes, cela sera preciser comme "native gel migration" dans les publis.
toll

[invite2232fa85]

oh merci !! que vous etes forts !!

[invitec9f0f895]

je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

Yoyo

[invite2a651650]

je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

Yoyo

a quand le eastern blot?
migration de lipides (autres que chromato), de glucides?

[invite97ea2302]

je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

Yoyo

Salut!
Yoyo, juste pour t'embêter, tu mets un P majuscule à poubelle?!!

sinon les conditions dénaturantes sont remplies par l'utilisation de SDS, le 2-mercaptoethanol et le DTT c'est encore autre chose!
++

[invite9695f11b]

Bjr je voulais savoir si le western immunoblot c'est bien ce que je pense où si je me trompe.

on fait tout d'abord une identification des protéines dans des extraits cellulaires à partir:
d'une électrophorèse c'est à dire séparation des protéines chargées sous l'effet d'un courant électrique.
ensuite on fait une immunodétection soit par la méthode directe ou indirecte:
méthode directe:
on utilise un AC Iaire marqué qui va fixé la protéine lui mm portant une enzyme qui va catalysé un substrat en un produit qui sera colorée
méthode indirecte:
on utilise un AC IIaire qui va reconnaitre AC Iaire. AC IIaire a lui ossi l'enzyme

ensuite on révèle les protéines et c'est là que je ne comprends pas trop mon cours ce que j'ai l'impression de comprendre c'est qu'on fait encore une électrophorèse puis une autoradiographie... est ce exact??

merçi!!

[invitea0443c8c]

Bonjour!

on fait tout d'abord une identification des protéines dans des extraits cellulaires à partir:
d'une électrophorèse c'est à dire séparation des protéines chargées sous l'effet d'un courant électrique.

Une "identification" n'est pas le bon terme. On charge sur un gel un lysat cellulaire (par exemple) contenant des protéines. Ces protéines vont être effectivement dénaturées (ou pas d'ailleurs, tout dépend de ce que l'on veut voir) et chargées négativement. Le courant électrique permet de faire migrer toutes les protéines dans le même sens (puisqu'elles ont toutes la même charge) et de les séparer selon leur masse moléculaire. La migration à traver le gel va dépendre de l'encombrement stérique de la protéine (et donc de sa masse moléculaire) : plus la protéine est petite/légère plus elle va migrer loin, plus elle est grosse/lourde et moins elle parcoura de distance après avoir été déposée sur le gel.

ensuite on fait une immunodétection soit par la méthode directe ou indirecte:
méthode directe:
on utilise un AC Iaire marqué qui va fixé la protéine lui mm portant une enzyme qui va catalysé un substrat en un produit qui sera colorée
méthode indirecte:
on utilise un AC IIaire qui va reconnaitre AC Iaire. AC IIaire a lui ossi l'enzyme

Oui c'est cela.
A noter que l'on utilise majoritairement la méthode indirecte, qui a l'avantage d'amplifier le signal car plusieurs anticorps secondaire peuvent se fixer sur le même anticorps primaire.

ensuite on révèle les protéines et c'est là que je ne comprends pas trop mon cours ce que j'ai l'impression de comprendre c'est qu'on fait encore une électrophorèse puis une autoradiographie... est ce exact?

Non, l'immunodétection que tu as décrit juste au dessus (directe et indirecte) est la dernière étape, et porte aussi le nom d'autoradiographie.
Entre la migration sur gel et l'autoradiographie tu as en plus une étape "d'électro-transfert" qui comme son nom l'indique permet simplement de transférer les protéines du gel vers une membrane (que tu vas ensuite utiliser pour faire l'autoradiographie), encore une fois grace à un champ électrique (car le sprotéine sont toujours chargées négativement).
Si on résume:
- chargement des protéines sur un gel
- migration
- transfert
- autoradiographie

Est-ce plus clair?

V.

[invite9695f11b]

oui merçi beaucoup!!

[invite9695f11b]

oui merçi beaucoup!! mais pour j'ai une petite précision quand àla migration et le transfert ce ne seraient pas la même chose ?
pour moi la migration se fait sur un support ( donc le gel) sous l'effet du courant..... donc elle inclut le transfert ( le transfert étant la migration du - vers le + en foction du Poids Moléculaire)

merçi.
dsl j'ai encore une petite quand on fait une électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes la migration se fait en fonction du poid moléculaire(PM) de la charge et de la forme je ne voit pas comment est ce qu'on peut le faire?
comment en fait migrent les protéines si il y a autant de critères du - vers le + parce que d'après moi les protéines chargées négativement vont migrer vers le pole + et c'est l'inverse pour les protéines chargées +, mais plus elles ont un PM faible plus elle migre vers le + et qu'inclut la forme???