ubiquitine et protéasome

[delstephie]

Bonjour a tous,

je souhaiterai savoir comment je peux démontrer la dégradation d'une protéine par le système ubiquitine protéasome ?

Le protéasome se situe au niveau cytosolique non ? Si ma protéine X d'intéret s'exprime au niveau nucléaire, et si je surexprime la protéine Y permettant d'apporter X à la voie de dégradation; est ce que je peux par un marquage spé de la protéine X montré sa dégradation? par exemple si le marquage de X se déplace du compartiement nucléaire vers cytosol ?

Merci

[Znomjo]

Pourquoi ne pas simplement marquer le protéasome et la protéine qui va être dégradée pas 2 fluorofores de couleurs différentes. Une juxtaposition des deux marquages pourrait révéler le même compartiment: le protéasome. Je ne sais pas si c'est vraiment réalisable ni si ça suffit pour montrer ce que tu veux mais c'est une idée!

[Yoyo]

Salut

autant que je sache Il y aurait un proteasome dans le noyau.
Pour tester il faut deja savoir si ta proteine est ubiquitinylée, ensuite il existe des mutants du proteasome et tu peux regarder si ta proteine est stabilisée dans ces mutants.

Yoyo

[delstephie]

Comment savoir si ma protéine est ubiquitinylée ? y a une manip facile?

[Znomjo]

Mais si il existe un protéasome dans le noyau, comment pourras-tu voir que ta protéine est accumulée dans le protéasome (en utilisant un mutant du protéasome)? Tu crois qu'on peut le distinguer grâce à une différence de concentration?

[Znomjo]

L'ubiquitination se fait essentiellement par phosphorylation il me semble, ajouter du phosphate radioactif permet peut-être de le voir (mais le phosphate est très utilisé dans la cellule ça risque de marquer tout et n'importe quoi...)

[delstephie]

Non si il existe un protéasome dans le noyau je ne peux pas faire ce que je pensais

[Yoyo]

salut

je confirme que le proteasome est nucleaire.
http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=5282781
http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/11/6223
http://www.signaling-gateway.org/upd...0/nrm1747.html

Pour les mutants, il existe des mutations thermosensibles, donc a tp° permissive les proteines sont degradées, a tp° restrictive la proteine est stabilisée donc avec un puls chase on voi un temps de 1/2 vie plus important.

Yoyo

[Znomjo]

En plus il est présent uniquement dans le noyau... Bah dis donc, je me coucherai moins bête ce soir.

[Toll]

bonjour,
pour tester l'hypothese que ta proteine d'interet est degradee par le proteasome, avant de se lancer dans la microscopie confocale ou manip de co-IP prot / ubiquitin qui necessitent de la mise au point, inhibe le proteasome par des inhibiteurs (ex: MG-132, ALLN,...) (manip qui marche bien et qui est simple).

si apres inhibition du proteasome, le niveau d'expression cellulaire de ta proteine est plus grand, tu pourras passer a l'etape suivant (ubiquitinylee? où? comment?)

toll

[Znomjo]

Comment s'appelle la protéine responsable de l'ubiquitination?? Elle a un nom particulier? Je ne me rappelle plus...

[delstephie]

Envoyé par Toll

bonjour,
pour tester l'hypothese que ta proteine d'interet est degradee par le proteasome, avant de se lancer dans la microscopie confocale ou manip de co-IP prot / ubiquitin qui necessitent de la mise au point, inhibe le proteasome par des inhibiteurs (ex: MG-132, ALLN,...) (manip qui marche bien et qui est simple).

si apres inhibition du proteasome, le niveau d'expression cellulaire de ta proteine est plus grand, tu pourras passer a l'etape suivant (ubiquitinylee? où? comment?)

toll

Merci pour les info sur les inhibiteurs.

Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?

[Vinc]

Salut!

Envoyé par delstephie

je souhaiterai savoir comment je peux démontrer la dégradation d'une protéine par le système ubiquitine protéasome ?

Tu mets un bloqueur du protéasome comme le mg132 et tu regardes l'accumulation de ta protéine par western blot.

Envoyé par delstephie

Le protéasome se situe au niveau cytosolique non ?

Envoyé par delstephie

En plus il est présent uniquement dans le noyau

Non il y a un protéasome dans le noyau ET dans le cytoplasme.

Envoyé par delstephie

L'ubiquitination se fait essentiellement par phosphorylation il me semble, ajouter du phosphate radioactif permet peut-être de le voir (mais le phosphate est très utilisé dans la cellule ça risque de marquer tout et n'importe quoi...)

Non ça dépend, il n'y a pas forcément phosphorylation avant ubiquitination, ce n'est pas le cas général (c'est en particulier valable pour la béta caténine et d'autres...).

Envoyé par delstephie

Comment savoir si ma protéine est ubiquitinylée ? y a une manip facile?

Montrer l'ubiquitination d'une protéine n'est pas une manip spécialement simple mais ce n'est pas impossible.
Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser. On purifie les lysats cellulaires et on fait un western avec l'Ab correspondant à la protéine étudiée (ou contre le tag si la protéine est taggée).
C'est une manip assez longue (5 bonnes sjournées voire plus), qui demande pas mal d'habitude et de méthode pour avoir un blot relativement propre à la fin. Il faut se placer dans des conditions particulièrement stringantes pour la purification et il y a vraiment moyen de galérer....
Et la quantification des blots est souvent indispensable pour pouvoir conclure...


Tu travailles sur l'ubiquitine? Sur le protéasome? Qu'est ce que tu veux montrer exactement???

A+
Vinc

[delstephie]

Envoyé par delstephie

Merci pour les info sur les inhibiteurs.

Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?

Et pour voir si la prot est ubitinylée je suppose qu il y a des encore anti-ubiquitine ?

[delstephie]

Envoyé par Vinc

Salut!

Tu mets un bloqueur du protéasome comme le mg132 et tu regardes l'accumulation de ta protéine par western blot.








Non il y a un protéasome dans le noyau ET dans le cytoplasme.



Non ça dépend, il n'y a pas forcément phosphorylation avant ubiquitination, ce n'est pas le cas général (c'est en particulier valable pour la béta caténine et d'autres...).



Montrer l'ubiquitination d'une protéine n'est pas une manip spécialement simple mais ce n'est pas impossible.
Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser. On purifie les lysats cellulaires et on fait un western avec l'Ab correspondant à la protéine étudiée (ou contre le tag si la protéine est taggée).
C'est une manip assez longue (5 bonnes sjournées voire plus), qui demande pas mal d'habitude et de méthode pour avoir un blot relativement propre à la fin. Il faut se placer dans des conditions particulièrement stringantes pour la purification et il y a vraiment moyen de galérer....
Et la quantification des blots est souvent indispensable pour pouvoir conclure...


Tu travailles sur l'ubiquitine? Sur le protéasome? Qu'est ce que tu veux montrer exactement???

A+
Vinc

Enfait on s'intéresse à une protéine et apparement elle serait dégradée par cette voie mais rien ne l affirme. Pour etre amené au protéasome elle aurait besoin d'une protéine particuliere. Or cette proteine particuliere je suis entrain de la cloner afin de la surexprimer dans un modele. Et ce qui m interesse s'est de savoir s'il y a vraiment interaction entre ces deux proteines et donc si elle est degradé par la voie ubiquitine...

Je ne suis peut etre pas assez claire

[Vinc]

Envoyé par delstephie

Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? ?

A ma connaissance le mg132 s'utilise sur toutes les cellules...

Envoyé par delstephie

Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?

Quelle ets la protéine que tu transfectes? c'est une E3 ou une autre protéine qui permet l'envoit de la protéine cible vers le protéasome??
Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation! Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point)...

Vinc

[Vinc]

Envoyé par delstephie

Et pour voir si la prot est ubitinylée je suppose qu il y a des encore anti-ubiquitine ?

Ca ne te donnera pas d'info car il y a un très grand nombre d eprotéines ubiquitinées : ce n'est pas spécifique de la protéine que tu étudies !

Vinc

[Znomjo]

Serait-ce possible de faire un mutant pour la protéine dont tu cherches le rôle??