[Biologie Moléculaire] Efficacité PCR quantitative

[Saule]

Bonjour,
J'ai besoin de lumière: lorsque je fais des manips de PCR quantitaive (absolue), il m'arrive parfois d'obtenir des pentes dans la courbe standard de l'ordre de -3.28, ce qui me donne une efficacité supérieure à 100%... Qu'est-ce que ça veut dire ?? Pourtant, la courbe standard est nickel et il n'y a qu'un seul pic... Merci à ceux qui peuvent m'aider !!

[malesore]

C'est normal tu peux avoir des taux supérieur à 100 % même jusqu'à 100 %, ton efficacité est bonne

J'espère avoir les mêmes choses d'ici peu .....

[IngDr]

Il est vrai qu'une efficacité supérieure à 100% et perturbant, car cela signifirait que d'un cycle sur l'autre, 1 brin matrice a été dupliqué plus d'une fois, ce qui, d'apres la théorie de la PCR n'est possible au cours du même cycle de PCR.
Mais dans ton cas, tu n'es pas bcp plus haut que 100% !!! Idéalement la pente doit etre autour de -3.32, tu n'es vraiment pas loin !!
Ne t'inquiètes pas pour cette valeur !

[Moumoutte]

Bonjour à tous,

pardonnez mon intrusion mais je saute sur l'occasion.

Je réalise également en ce moment des Q-PCR et je dois reconnaitre que cette courbe standard, c'est completement du chinois pour moi.

Est-ce que l'un d'entre vous pourrait me dire à quoi elle correspond? Comment se calcule t-elle? A partir de quels points? Que signifie une valeur de -2 ou de -4 (j'ai déjà obtenu les deux!)?

Enfin bref, toute information sera bonne à prendre.

Merci d'avance

[malesore]

Je vois que pleins de monde s'amusent en Q-PCR en ce moment, moi je m'y mets enfin sans tarder après moultes questions ici et un procotole carré (enfin j'espere ...)

[Patfol]

Le question de moumoute m'interresse aussi, j'ai juste la chance de voir quelqu'un en faire une pour le moment j'ai pas pu trop m'y pencher dessus.
(Malesore vous êtes doctorant dans quel labo a nancy ?)

[malesore]

Je suis à l'INRA à nancy, plus exactement sur le centre INRA de champenoux (bled paumé dans la forêt à côté de nancy), tu connais ?

[Patfol]

(De nom oui, j'ai eu une prof venant de la bas, j'ai fais ma licence sur nancy en faite, je pensais que tu faisais une thèse au sein même de l'uhp en faite)

[malesore]

Ben je fais en partie mes manips là bas aussi, à la fac

[malesore]

et moi mon Master à Strasbourg

[Saule]

Merci pour vos réponses, si j'ai bien compris, je suis arrivée dans les limites de la modélisation donc je n'ai plus à m'inquiéter !

[IngDr]

Envoyé par Moumoutte

Bonjour à tous,

pardonnez mon intrusion mais je saute sur l'occasion.

Je réalise également en ce moment des Q-PCR et je dois reconnaitre que cette courbe standard, c'est completement du chinois pour moi.

Est-ce que l'un d'entre vous pourrait me dire à quoi elle correspond? Comment se calcule t-elle? A partir de quels points? Que signifie une valeur de -2 ou de -4 (j'ai déjà obtenu les deux!)?

Enfin bref, toute information sera bonne à prendre.

Merci d'avance

J'ai fait un petit résumé en PDF sur le calcul de l'efficacité. J'espère que ca t'éclairera. Je pense que ca peut etre utile pour comprendre le principe de la QPCR.

Cordialement,

[Moumoutte]

Envoyé par IngDr

J'ai fait un petit résumé en PDF sur le calcul de l'efficacité. J'espère que ca t'éclairera. Je pense que ca peut etre utile pour comprendre le principe de la QPCR.
Cordialement,

Ouah ! Merci IngDr!!!

Je n'en demandais pas temps. Mais néanmoins, c'est exactement ce que je cherchais, je ne parvenais pas à comprendre ce coefficient directeur de la droite. Merci donc pour cette explication détaillée.

Une dernière question (quand même pour la route): comment sait-on alors si E est compris entre 0 et 1 ou entre 1 et 2?

Car une chose m'intrigue: lorsqu'on fait le calcul pour savoir de combien doit être la pente pour avoir une efficacité maximale égale à 1 (donc dans le cas ou E est compris entre 0 et 1) et bien on tombe sur une pente = -1 / log 1 qui mathématiquement impossible.
Je suppose donc que tous les calculs sur l'efficacité partent du principe que E est compris entre 1 et 2. Dans quel cas utilise t-on, donc, les valeurs comprises entre 0 et 1?

Et encore merci. Et merci d'avance.

[IngDr]

Il est bon de temps en temps de rappeler la base des choses, ca permet de comprendre ses résultats et de mieux interpréter.

Dans le cas des calculs que j'ai détaillé, E se situe entre 1 (pas d'amplification) et 2 (amplification de toutes les cibles). C'est la convention utilisée par Roche pour le LightCycler
En fait pour d'autres (il me semble sur le ABI Prism), cette valeur que n'est pas l'efficacité, mais 1+l'efficacité, car pour eux l'efficacité est entre 0% et 100% d'amplification ! Bref, faut juste savoir de quoi on parle.
Pour avoir une amplification idéale, (E=2), ta pente doit être de -3.32.
Dans l'autre convention, le calcul 10^(-1/pente) => 1+e, e étant l'efficacité en %.
J'espère que je suis suffisamment clair.

[Moumoutte]

Oui ok! C'est bon! Tout est clair! Juste une histoire de convention!
Merci!

D'autant plus que je bosse sur le LightCycler donc je vais suivre ta démonstration à la lettre.

Merci encore! Je reviendrai taper à la porte pour un autre problème !!

A+