decomposition d'une glycoproteine

[logan138]

Bonjour a tous,

Je suis actuellement en thèse de chimie et je travaille sur des glycoprotéines (GP).

Je cherche à effectuer une analyse des constituants de mes GP en sucres et acides aminés.

Pour libérer les sucres, je pense faire une méthanolyse acide (NeOH, HCl) et ensuite, je dérivatise mes sucres par triméthylsililation pour une analyse GC

Première question, est-ce que ma méthanolyse va coupé la liaison sucre peptide???

Mais pour le peptide, je bloque, car je ne sais pas comment les isolés et surtout comment les fragmenter "proprement". J'ai lu que l'on peut hydrolyser les peptides avec du HCL 6M à 110°C, mais entre autre, cela dégrade la trp et la cys.

Connaitriez vous une méthode pour isoler et casser mon peptide sans détruire d'aa?

je vous remercie d'avance pour votre réponse

Logan

ps : pour le peptide, j'ai pensé à une enzyme et je vais donc poser la question dans la section bio

[iouou]

Pour la rupture de la protéine, plusieurs méthodes existent. (Au fait, il me semble qu'on parle de peptide en dessous de 10 AA, de polypeptide jusque 100 et au delà, de protéine).
Tout dépend si tu veux la fragmenter en petits morceaux ou si tu veux en déterminer la séquence pas à pas, acide aminé après acide aminé.
Pour la fragmentation en morceaux, on utilise en effet des enzymes telles que la chymotripsine ou la trypsine, mais on utilise aussi très couramment le brumure de cyanogène, qui a la particularité de rompre la chaine seulement après une Met. Comme les protéines en contiennent un nombre raisonnable, cette méthode est plutôt bien adaptée.

Pour l'identification de la structure primaire pas à pas, on peut choisir de travailler sur l'extrêmité N-terminale (voir réaction d'Edman) ou sur l'extrêmité C-terminale (voir méthode de Starck).
Pourrais-tu nous en dire plus ?

[iouou]

D'ailleurs, les deux dernieres méthodes ne sont pas destructives. Je pense qu'un milieu acide à chaud provoquerait la rupture brutale de toutes les liaisons peptidiques...

[logan138]

Merci pour ta réponse
Je cherche a couper toute mes liaisons peptidiques afin de pouvoir identifier les différent aa present dans le polypeptide par GC....
Pour le moment, je n'en suis pas a du sequençage.

Pour la fragmentation en morceaux, on utilise en effet des enzymes telles que la chymotripsine ou la trypsine, mais on utilise aussi très couramment le brumure de cyanogène, qui a la particularité de rompre la chaine seulement après une Met. Comme les protéines en contiennent un nombre raisonnable, cette méthode est plutôt bien adaptée.

L'inconvenient de la chymotripsine ou la trypsine, c'est que ces enzymles sont spé d'une liaison particiulière. Pareil pour le brumure de cyanogène, il ne coupera pas toute les liason poeptidique. N'existe t il pas une enzyme qui serait spécifique de la liaison peptidique??? qui aurais en quelque sorte la meme action que le HCl à chaud mais non destructif comme le HCl?????

[HarleyApril]

usuellement, on utilise quand même HCl à chaud !

cordialement

[logan138]

dans ce cas comment fait on pour analyser les aa qui se degrade lors de se traitement????