optimisation pcr quantitative temps réel

nadege · 01/02/2005, 18h03

hello

je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.
c'est une question bien complexe..
merci

Meningo · 01/02/2005, 20h27

Je suis assez étonné que tu veuilles augmenter la spécificité de la réaction : il me semble qu'en faisant un bon design des amorces et si en plus tu utilises une sonde, ça devrait être satisfaisant...

**piwi** · 01/02/2005, 22h45

parfois on peut ajouter dans les pcr une phase de prédénaturation.
ca peut etre sous la forme d'une incubation à chaud ou alors d'une étape simple sur ton thermocycleur.

Sinon il m'est arrivé d'ajouter du dmso... (ca fait très longtemps ce protocole par contre et je ne l'ai plus en tête.)

Dans les deux cas le but n'est pas d'augmenter la spécificité de tes amorces que tu as normalement designé au mieux. le but est de mieux dénaturer l'ADN qui, pour une raison ou une autre, peut être diffcilement accessible à tes amorces.

Igothigh · 02/02/2005, 18h11

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Posté par nadege

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je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.
c'est une question bien complexe..
merci

Ca parait bien complexe en effet... a part le design des primers, je ne vois pas trop mais je suis loin d'être un spécialiste de la PCR. Voici l'adresse d'un site qui pourra peut-être te donner des tuyaux, même si les infos ne sont pas spécifiques à la Q-PCR.

adeline sa · 20/02/2006, 21h18

salut moi aussi dans la cadre de mon mémoire je dois utiliser la pcr en temps réel.
JE cherche des documents pour sa rédaction, pourrai tu m 'aider?

Idrix · 21/02/2006, 11h18

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Posté par nadege

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je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.
c'est une question bien complexe..
merci

Tu peux travailler sur tes conditions de cycle : température d'hybridation plus haute, montée progressive de la température pour arriver à 72 °C, voire même travailler avec des amorces plus longues avec des Tm de 60-62°C et travailler en cycle avec 2 températures : 68°C (hybridation/élongation) et 94°C (dénaturation).
Evidemment kit "Hotstart"...
a+