Réactifs de biomol

Meningo · 03/05/2005, 11h14

Bonjour,
Je suis à la recherche du rôle et eventuellement du mode d'action de plusieurs réactifs utilisés en bio mol, du genre tris-HCl, Triton... je ne trouve pas grand chose.
Connaissez-vous des sites où je pourrais trouver des infos dessus ?
Par la même occasion, si vous connaissez le rôle de ces 2 réactifs, merci de me faire signe.

Meningo · 03/05/2005, 11h24

Oupss...
J'ai trouvé (pas grand chose sur le net, mais sur des bouquins).
Désolé...

**Yoyo** · 03/05/2005, 11h30

alors c'est trop tard?

sinon le tris-HCl est un tampon, comme le tris est un sel tres basique, on le mets au bon pH avec de l'HCl. Mais faut savoir que le pouvoir tamponnant n'est pas extraordinaire, comparé a de l'HEPES par expl.

Le triton est un detergeant doux.

Yoyo

Meningo · 03/05/2005, 13h45

Merci yoyo.
En effet pour le tris-HCl, j'ai trouvé mais ce que je comprennais pas c'est que pour le triton on peut lire que c'est un détergent, un tensioactif, et ....autres dont je ne me souviens plus. Je n'étais plus trop sûr de son utilité dans mes manips. Détergent me va très bien.

Temps que j'y suis, les colonnes d'extraction d'acides nucléiques sont des colonnes échangeuses d'ions, c'est bien ça ? Dans ce cas, je ne me souviens plus par quel mécanisme se fait l'élution des acides nucléiques (tampon contenant une faible concentration en sels dixit Mme la Notice d'Utilisation). Ce sont des choses que j'ai pourtant rabachées, mais je ne vois plus trop le lien entre le changement de charge et la concentration en ion...

(Ca sent le matériel et méthodes tout ça

.....)

le_troll · 03/05/2005, 16h51

ben si ton ion c'est H+ tu chqnge ton pH donc ta charge

plus serieusement j'ai pas etudie la question, mais si mes souvenir sont bon augmenter la concentration en ion revient a augmenter la competition entre les charge pour la colonne.
Pour etre claire si tu as une colonne d'annion qui capte les cations, si tu augmentes la concentration en cation dans ta colonne, ceux ci vont logiquement entrer en competition avec ta molecule cationnique

ZionAngel · 03/05/2005, 17h47

Bonjour !
Merci pour ces reponses sur le Tris-Cl (je l'ai utilisé dans ma maxipreps, c'est un composant du tampon p1 qui sert à resuspendre le culot d'ADN, enfin il me semble

).
J'aimerai avoir des precision sur les préparations de cultures cellulaires animales (humaines pour etre plus précis) après transfection. En effet, on m'a dit qu'on ajoutait du DMEM contenant tout ce dont à besoin les cellules pour croître, à savoir nutriments, sels minéraux ... On ajoutait aussi un antibiotique pour selectionner les cellules ayant incorporait le plasmide (dans mon cas, c'est amp). On y a aussi ajoutait un sérum contenant un facteur de croissance (un EGF pour notre expérience). Et enfin, on y a ajouté un truc appelé Fung je crois. Ca sert à quoi ? On m'a dit que ca avait rapport avec les mycètes, mais quel est l'intérêt de mettre une solution pour mycètes dans un milieu de culture de cellules humaines ... ??
Une autre petite question, on ajoute du PBS 1x à 4 degré celsius pour l'extraction des protéines... Ca agit comment et ca sert précisément à quoi ?
Merci de m'éclairer

**Yoyo** · 03/05/2005, 18h41

Salut,

Je crains que tu ne confondes beaucoup de chose!
-La solution P1 est pour resuspendre le culot de bacteries, pas d'ADN!
-Apres transfection on ne selectionne pas a l'ampicilline les clones ayant recu un insert. Les cellules animales sont resistantes naturellement aux ampicillines (heureusement pour nous!). La plus part des transfection sont faites de maniere transitoires (pas de replication, pas de selection). Pour les stables on utilise un antibiotique adequate.
- le produit fung est probablement un antifongique, justement pour EMPECHER le developpement de champignons et autres levures dans ton milieu de culture.

_le PBS est une solution saline isotonique, et le fait qu'elle soit a 4°C permet de limiter la protéolyse des protéines.

Yoyo

nayeki · 03/05/2005, 19h48

Hello

Tout à fait d'accord avec Yoyo, j'aimerais bien savoir qui t'a dit que l'ampicilline sélectionnait ton plasmide

Sinon le PBS est souvent utilisé pour des prép' de protéines (western blot etc) à 4 degré ca minimise la désactivation des protéines (par perte de conformation) et également la protéolyse (même s'il existe des inhibiteurs de protéases sur le marché....)

Dernier rappel: les mycètes sont les pires contaminations en labo (surtout les levures) :

Etant Eucaryotes, ils sont insensibles aux antiobiotiques classiques,
Ils poussent terriblement vite, sporulent très efficacement etc... vraiment faire attention, surtout en ce moment (avril-mai très favorable aux levures sauvages...)

nayeki · 03/05/2005, 19h49

Citation:

Posté par Meningo

Merci yoyo.
En effet pour le tris-HCl, j'ai trouvé mais ce que je comprennais pas c'est que pour le triton on peut lire que c'est un détergent, un tensioactif, et ....autres dont je ne me souviens plus. Je n'étais plus trop sûr de son utilité dans mes manips. Détergent me va très bien.

Temps que j'y suis, les colonnes d'extraction d'acides nucléiques sont des colonnes échangeuses d'ions, c'est bien ça ? Dans ce cas, je ne me souviens plus par quel mécanisme se fait l'élution des acides nucléiques (tampon contenant une faible concentration en sels dixit Mme la Notice d'Utilisation). Ce sont des choses que j'ai pourtant rabachées, mais je ne vois plus trop le lien entre le changement de charge et la concentration en ion...

(Ca sent le matériel et méthodes tout ça

.....)

Le tampon d'élution est de l'eau pure (millipore)

Meningo · 03/05/2005, 19h56

Citation:

Posté par nayeki

Le tampon d'élution est de l'eau pure (millipore)

Pas chez M. et Mme ROCHE en tout cas.... Il y a au moins du NaCl (enfin un sel) plus autre chose je crois.

nayeki · 03/05/2005, 20h59

Citation:

Posté par Meningo

Pas chez M. et Mme ROCHE en tout cas.... Il y a au moins du NaCl (enfin un sel) plus autre chose je crois.

Ca sert à rien

au pire tu peux ajouter un peu de Tris-EDTA...

Meningo · 03/05/2005, 21h12

Je resitue le problème (ce que j'aurais du faire au départ) :
J'utilise un kit commercialisé d'extraction d'ac nucl. Je cherchais à comprendre l'utilité de chaque réactifs (ça c'est fait...)
Maintenant je cherche à comprendre comment l'élution des AN s'effectue : dans la composition de mon tampon d'élution (compris dans le kit

) ils insistent sur le fait que la concentration en sels diminue. Donc j'imagine que c'est cette diminution de concentration en sel qui permet l'élution des AN, mais par quel mécanisme ?

Comme l'a dit le_troll, je pensais que c'était dû à un echange d'anions, mais le seul anion dans le tampon est du Cl-....et je sais pas si c'est par cette voie là que les AN sont liberés.

ZionAngel · 04/05/2005, 00h23

Humm !
Merci pour ces grosses rectifications !

Je note tout ca dans mon beau cahier deja tout dégeulasse du plan de travail

Pour ce qui est du plasmide dans la cellule euh bah ... je sais pas, on m a dit qu'on mettait de l'antibiotique... Mais apparemment pas pour sélectionner les cellules mais pour éviter l'éventuelle contamination par des bactéries, au meme titre que Fung apparement ??