hplc c18 tres technique

grenouille31 · 21/10/2005, 13h30

Bonjour !
voila, j'ai un soucis avec l'hplc,
je dois analyser de la thyroxine ( HORMONE )
J'ai une colonne c18.
j'utilise l'acetonitrile comme eluent, avec surement du tfa a 0.1 %.
la machine sur laquelle je travaille date des annees 20 ( ou presque !

)
alors je suis en isocratic ( ca se dit comme ca ?, )
mon probleme est de trouver ma bonne proportion acetonitrile/eau distille.
a ce que j'ai compris ca depend de la polarite de ma thyroxine.
chose que je n'arrive pas a trouver.
enfin c'est un peu le brouillard quoi !
help, please !

pluton35 · 21/10/2005, 14h00

J'ai trouvé dans :
A micromethod for quantitative determination of iodoamino acids in thyroglobulin
N Baudry, B Mallet, PJ Lejeune, L Vinet, and JL Franc
Journal of Endocrinology, Vol 153, Issue 1, 99-104

Citation:

The procedure involves separation of monoiodotyrosine (MIT), di-iodotyrosine, tri-iodothyronine and thyroxine by reverse phase HPLC with a Vydac C18 stationary phase and a mobile phase of water-acetonitrile-acetic acid

J'ai pas accès à la publi mais tu n'as plus qu'à la trouver...

shaddock · 21/10/2005, 14h42

Bonjour

"A C18 column with a mobile phase 80:20:0.2 methyl alcohol

I water

hosphoric acid at 1mL/min gave a good separation of the l -thyroxine peak from the methyl alcohol".

Extrait de: http://www.osha-slc.gov/dts/sltc/met...17/pv2117.html

Good Luck

grenouille31 · 21/10/2005, 15h33

merci shaddock, ton lien est bien....seulement j'aimerai garder mon acetonitrile et mon tfa, car j'ai deja une ebauche de methode ( mais alors vraimment une ebauche, hein, elle fait trois ligne !!!

)

tu sais quoi, pluton35, la plupart des articles du journal d'endocrinology sont gratuit en ligne, sauf celui ci !.
mais bon, suis sure que vais trouver kkpart.
any other suggestion ?

grenouille31 · 21/10/2005, 15h38

aussi,
quelqu'un a une idee sur la polarite de la thyroxine , acetonitrile ?/
merci !!!

Loutchos · 21/10/2005, 15h44

Je ne comprends pas ta question. Il n'y a aucune théorie qui permette de prédire quelle proportion d'éluant tu dois utiliser.

Le mieux n'est-il pas d'essayer ? Lance-toi !
Essaye un mélange 80-20 (acétonitrile-eau) et vois si ca sort trop tot ou trop tard...

grenouille31 · 21/10/2005, 16h15

ben oui, je sais , c'est un peu flou...........
mon tfa arrive la semaine prochaine......
j'ai deja essaye sans tfa, avec un melange a peu pres 70;30.
et ben, c'est pas top.......
j'ai plein de pics de partout qui ne ressemblent meme pas a des pics, du coup j'arrive pos a identifier mon pic de thyroxine ( si il existe...) et ma baseline est merdique ( en restant poli, hein...)
alors moi, je stresse un peu parce que il faut que ma chimie soit au point dans 15 jours parce que mes grenouilles sont en train d'ovuler ( je suis pas chimiste, je bosse avec des grenouilles !!!)
et question articles scientifiques, ben il y a pas grand chose...,
alors dans l'ideal, quelqu'un qui aurait deja bosse avec avec cette hormone, ce serait parfait !
mais bon, faut pas rever, hein ?

shaddock · 21/10/2005, 17h18

Est-ce que ta colonne est bien stabilisée, si la ligne de base part en biais..? Sinon cela pourrait aussi expliquer "les patates".

Loutchos · 21/10/2005, 18h30

Et est-ce que tu peux sortir un bon pic avec un produit pur bien connu ?

grenouille31 · 21/10/2005, 19h23

alors ma ligne de base elle est souvent penchee, mais logiquement, la colonne est stable.....
peut etre qu'elle peut bouger un peu quand j'injecte....
mais, normalement, il faut la bloquer ?
j'ai l'impression que les techniciens du labo ont plutot l'habitude de la laisser "trainer" comme elle est," tant pis si elle n'est pas posee completement a plat !"

c'est vrai que je n'ai pas essaye avec un autre compose que la thyroxine....mais, pour l'instant je bosse avec les standards, j'en suis pas encore aux echantillons,
donc dans ce que j'injecte, il n'y a que de l'eau distille, de la thyroxine qui a ete "dissoute" grace a de l'hydroxide de sodium,
mais pour mes prochains standards je pense diluer avec un melange d'acetonitrile/eau distille,
suppose marcher mieux, non ?

quand a mes echantillons, c'est de l'eau du robinet filtree, avec la thyroxine et toute les cochoneries que mes tetards peuvent rejeter,,......

je me souviens un des techniciens dire que l'hydroxide de sodium, peut provoquer un precipite dans la colonne, et peut la bloquer.
il est vrai que lors de ma derniere experience qui impliquait de l'acide iopanoique, dissous lui aussi avec l'hydroxide de sodium, la colonne s'est bloque et il a fallu la nettoyer " a l'envers "
avec du methanol, si je me souviens bien.....
quelqu'un peut confirmer ?

cheers !

Fajan · 21/10/2005, 19h50

bete question, mais avec NaOH, tu fais des ions, ta colonne est apolaire? au sinon ca reste coincé dessus

grenouille31 · 21/10/2005, 20h17

oui, C18 phase inverse.....
je pense bien que c'est apolaire....

merci pour le "bete" ah ah...
et puis l'acetonitrile, c'est un eluant polaire non...???

mais j'ai pas trop le choix, dans mes echantillons, je suis oblige d'utiliser l'hydroxide de sodium, pour dissoudre T4, le but c'est de ne pas utiliser un solvent source de carbonne, pour ne pas entrainer une proliferation bacterienne dans mes aquariums ( si ca vous interresse de savoir .....)

donc en gros il faudrait que je nettois ma colonne apres chaque utilisation?
bonjour l'ambiance !!!

toujours pas de reponse pour mes histoire de baseline et de patates ???

merci ..a tous...

Trapamoosch · 22/10/2005, 01h32

Quel est ton détecteur de ta chaine HPLC ?

Il semble y avoir quelques infos là dedans : http://www.clinchem.org/cgi/content/full/48/4/637

laura7777 · 21/10/2006, 10h23

tu veux analyser une molécule qui a une fonction acide et basique. Le pH de ta phase mobile est donc tres important. Un Ph mal adapté peut entrainer plusieurs pics (molécules plus ou moins ionisé). Si tu veux garder l'acetonitrile , garde le. Mais je te conseillerai d'ajouter de l'eau et de l'acide acetique (par rapport à TFA) car c'est un acide plus faible. Vérifie le Ph de ta phase mobile, il faut qu'il soit entre les 2 pka de ta molécule si tu veux l'étudier sous sa forme neutre.

laura7777 · 21/10/2006, 10h28

tu fais une phase A d' eau à 0,1% d'acide cétique par ex. Puis une phase B à 0,1% d'acide acétique. Puis du démarre un gradient pendant une heure de 100% de A jusqu'a 100% de B. Tu vois ou ton pic sort et tu en deduis les bonnes proportions d'eau et d'acétonitrile.

djamili · 14/12/2006, 18h49

Citation:

Posté par laura7777

tu fais une phase A d' eau à 0,1% d'acide cétique par ex. Puis une phase B à 0,1% d'acide acétique. Puis du démarre un gradient pendant une heure de 100% de A jusqu'a 100% de B. Tu vois ou ton pic sort et tu en deduis les bonnes proportions d'eau et d'acétonitrile.

Bonjour : je suis un jeune praticien (d’ans le domaine agroalimentaire) ; ainsi, j’aimerais bien avoir quelques informations

Nous avons une machine HPLC marque SHIMADZU avec une colonne C18 et un détecteur UV vis ( je sais que la phase stationnaire et apolaire, c-a-d que la phase mobile doit être polaire : eau, méthanol, acetonetril …)
• J’ai lu que pour l’échantillon il faut un PM < 2000 ; alors, comment calculer un PM d’une solution ( donnez un exemple si c’est possible)
• Je veux faire une petite démonstration facile pour les jeunes élèves. Ainsi, je ne sais quel échantillon choisir !
• Puis-je utiliser une limonade ? Dois-je l’injecter pur ou en gradient (dilution). Ne risque t’elle pas d’endommagé la colonne ?

Merci d’avance et à bientôt.

laurisa · 15/12/2006, 20h29

Salut,

Citation:

Posté par djamili

• J’ai lu que pour l’échantillon il faut un PM < 2000 ; alors, comment calculer un PM d’une solution ( donnez un exemple si c’est possible)

Le PM correspond à le (aux) molécule(s), que tu souhaite séparer et non à la solution.

Citation:

Posté par djamili

• Puis-je utiliser une limonade ? Dois-je l’injecter pur ou en gradient (dilution). Ne risque t’elle pas d’endommagé la colonne ?

Je dirais que telle quelle, c'est plutôt risqué... tu risque de ne pas éluer certains composés qui vont empoisonner ta colonne. Tu peux essayer d'en faire une petite extraction...

Citation:

Posté par djamili

• Je veux faire une petite démonstration facile pour les jeunes élèves. Ainsi, je ne sais quel échantillon choisir !

ça dépend du détecteur. Mais si tu as un UV-visible (barettes de diodes), il me semble (à vérifier) que les colorants alimentaires (vendus par trois) sont un exemple facile et qui marche plutôt bien.

Fajan · 15/12/2006, 21h07

Tu peux montrer la caféine dans le coca!

Pour ca, tu dois diluer ton coca dans de l'eau et injecter.

La caféine révèle aux UV