Méthodes de lyse bactérienne

Dr_T · 15/01/2006, 11h46

Salut tout le monde

J'ai une question un peu bizarre qui pourtant apelle une réponse...

On a une souche de bactos standard (des E.Coli) qu'on a lysé par lysozyme + lyse mécanique.
La question a laquelle je fais face est

Pourquoi plusieurs procédures d'ouverture des cellules bactériennes peuvent-elles être envisagées? Quelle est la méthode la plus efficace pour une souche d'E.Coli. ?

ce a quoi j'ai répondu

Selon la nature des expérimentations a mener, on peut utiliser plusieurs méthodes pour ouvrir une cellule. Il apparaît que E. Coli résiste mieux à la lyse par lysozyme/PMSF. On aurait pu utiliser entre autres
la lyse osmotique (solution sucrée, saline, ionique)
la sonication
une lyse uniquement mécanique (moins courante)
une lyse uniquement enzymatique
La technique choisie dépend aussi du type de bactérie (Gram +/-)

Mais sans grande conviction... Apres avoir demandé au prof ce qu'il en pensait, il avoue ne pas saisir l'interet de la question...

Quelqu'un a une idée?

gorben · 16/01/2006, 18h23

Salut

Il y a plusieurs type de lyse, la douce (SDS, lysozyme, chox osmotique ou temperature) ou la dure (presse de french, sonication)

Tu dois adapter ta lyse à tes bacteries mais aussi a ce que tu veux faire aprés.
Par exemple, tu ne pourras pas ou mal lyser une gram+ tant que tu n'aura pas degradé la paroi.
A l'inverse, le lysozyme n'est pas d'une importance majeure pour des bacteries gram-.
Il n'est pas recomandé non plus de soniquer tes echantillons si tu veux en extraire l'ADN (il est cassé en tout petit morceau). De meme, la lyse au SDS est dangeureuse si tu comptes utiliser des proteines sous forme native.

Le PMSF est un inhibiteur de protease, je ne crois pas qu'il participe à la lyse.

Voila, j'espere que je t'eclaire un peu.

**Yoyo** · 16/01/2006, 21h31

Bonsoir

en effet le PMSF est un inhibiteur de protéases. Sinon lorsque l'on extrait de l'ADN plasmidique de coli, la methode la plus habituelle est la lyse alcaline en utilisant de la soude.

En fait tout depend en effet de ce que l'on regarde, ce que l'on cherche a identifier etc... Mais coli est plutot une bacterie "facile" a lyser par rapport a des gram+. Par expl quand on veut faire des PCR sur colonies on lyse les bacteries uniquement en les faisant chauffer 5 min a 100°c.

Yoyo

Dr_T · 17/01/2006, 12h51

Ouais, le PMSF n'avait pas a voir avec le sujet, mais il était mis comme ca dans mon rapport et ... et je m'a pas relu

avant de poster...

Merci pour vos réponses, en tout cas...

smatt · 22/02/2007, 16h17

J'aimerais savoir si quelqu'un a déjà tenter de lyser la bactérie C.difficile (gram+)? Quel méthode de lyse vous avez utilisé? A-t-elle été efficace??

Merci!

wishangel · 23/02/2007, 11h22

Salut a toi,
j'ai jamais fait sur difficile mais sur perfringens et de nombreuse gram +. J'ai tester deux technique. Soit une lyse meca à l'amalgamateur à bille (bead bitter) soit une lyse chimique au lysozyme. Moi je fait ça pour l'extraction d'ADN et les deux méthode donne de bon rendement.

sacharybalka · 23/02/2007, 13h07

Bonjour, je prends le train en route...
Peut-on vortexer vigoureusement si on n'a pas de bead bitter? J'extrait l'ARN directement du sol, les billes font 0,1mm. Ca a l'air de marcher, mais mes rendements ne sont pas féeriques...
Merci

**Yoyo** · 23/02/2007, 13h40

Oui le vortex est utilisable a condition que les echantillons soient maintenus au froid et que le vortex soit suffisament efficace.

YOyo

smatt · 23/02/2007, 17h16

Bonjour wishangel,
Je connais pas la méthode lyse meca à l'amalgamateur à bille (bead bitter). Peux-tu me donner plus de renseignement sur cela? Peut-être un site internet??

Merci beaucoup

wishangel · 24/02/2007, 11h53

désolé j'ai mal orthographier!!!! C'est beadbeater et non pas beadbitter. Perso j'utilise le mini beadbeater 8, pour avoir une appercu de l'engin je te laisse le site : http://www.biospec.com/MiniBeadBeater_8.htm

si tu as encore besoin hesite pas