Osmose (Biologie/chimie)

[BrigitteS]

Hello !

J'ai besoin d'utiliser un fixateur histologique et je ne trouve pas le calcul pour obtenir l'osmolarité de cette solution de fixation (soluté et solvant)

Formule :

1. g Acide picrique dans 150 ml d'alcool 80%
(C6H3N3O7 / Mr : 229,11)
+ 60 ml Aldéhyde formique à 37% (HCHO)
+ 15 ml Acide acétique glacial (CH3COOH)

Merci de votre aide

Brigitte

[JPL]

Bon, ça, c'est du liquide de Bouin alcoolique (ou fixateur de Duboscq-Brasil). En fait pour ce genre de fixateur on n'a pas à se préoccuper de l'osmolarité d'autant qu'on est en solution alcoolique. L'osmolarité par contre est importante pour les fixateurs de microscopie électronique (tels que glutaraldéhyde, tétroxyde d'osmium).
Ce type de formule alcoolique n'est pas d'usage très fréquent, du moins dans mes lointains souvenirs, comparé au liquide de Bouin ou de Bouin-Hollande qui sont des solutions aqueuses. On s'en sert (enfin je m'en servais) quand on a besoin d'un pouvoir pénétrant important.

[BrigitteS]

Merci JPL

Est-il alors utile de calculer l'osmolarité de la solution acqueuse de Bouin lors de la fixation par immersion de tissus (dans mon cas, je trouve des fractures dans mon tissu et j'envisage que ce problème pourrait être dû à une différence d'osmolarité entre ma solution de fixation et ce tissu)?
Si c'est le cas comment procéder pour calculer l'osmolarité de fixateur Bouin avec la formule suivante :

Acide picrique saturé 150 ml
Formol 37% 50 ml
Acide acétique glacial 10 ml

Encore merci pour votre précieuse aide

[JPL]

Je n'ai jamais vu un calcul d'osmolarité pour un fixateur de microscopie optique. Pour ce qui est des fractures, tout dépend de la taille de la pièce, de sa consistance initiale, du moment où ces fractures se produisent (ne pas oublier la phase de déshydratation alcoolique et l'imprégnation par le solvant de la paraffine - menée plus ou moins en douceur). Les problèmes d'osmolarité que j'ai pu voir en microscopie électronique se traduisent plutôt par des gonflements ou des rétractions de cellules, et pas par des fractures.
Peux-tu en dire plus sur la nature du tissu, la taille des pièces...

[BrigitteS]

Re,

Je travaille actuellement avec du tissu embryonnaire (pièce de 4-5 mm, très délicate à la manipulation).

Pour ce problème de fractures je procède par élimination.
Dans un premier temps j'ai pensé à un problème d'osmolarité entre le fixateur D.-B. (?) et le tissu (300 mOsm), d'où ma question sur ce forum.
(J'ai lu dans un article qu'un fixateur "hyperosmotique" pouvait provoquer des fractures.)
Il est vrai que dans les recettes satandard de préparation de ce fixateur on ne mentionne pas de calculer l'osmolarité.

Les fractures intercellulaires ne sont visibles au MO qu'après coloration des coupes (10 um) et n'apparaissent que sur les bords extérieurs du tissu.

Procédure :
- fixation D.-B. 3-4 jours
- deshydratation alcool 96% : 3 heures
- solvant paraplast (N-Butanol) : 1 jour 1/2
- bains de paraplast (60°C) : 2 jours
- enrobage

Ce type de fractures pourraient-elles être provoquées par des temps de deshydratation ou de passage dans le solvant du paraplast trop longs (là est aussi la question)?

Je travaille aussi avec des pièces de plus petite taille (2 mm) et le problème des fractures n'apparaît pas malgré la même traitement !!!

Peut-être que l'utilisation du Bouin aqeux serait préférable pour ce type de tissu ?

Connaissez-vous aussi le solvant N-Butanol?

Voilà, je m'arrête là.

[JPL]

Le Bouin alcoolique peut en effet provoquer des contractions par fuite d'eau au moment de la fixation. La contraction est attestée par le fait que les petites pièces ne montrent pas de défaut. Le butanol est un bon solvant intermédiaire. Je l'ai utilisé systématiquement dans ma jeunesse pour des inclusions à la paraffine. Je ne sais pas ce qu'il vaut avec le paraplast que je n'ai pas utilisé. En tout cas c'est mieux que le traditionnel toluène qui durcit les pièces, et moins toxique. Par contre l'odeur... beurk !
Odeur moins dégueulasse : le butanol tertiaire additionné d'un peu de n-butanol (parce que le butanol tertiaire a un point de cristallisation voisin de la température ambiante).
PS : utilise-t-on encore l'historique traité de microscopie de Langeron pour ces recettes ?

[BrigitteS]

Re,

D'après votre expérience, n'observerait-on pas plutôt des désordres dans la morphologie des cellules à l'observation des coupes colorées plutôt que des fissures extracellulaires (si le fixateur a provoqué des contractions au moment de la fixation)?

C'est vrai que le N-butanol a une odeur repoussante mais avec une bonne hotte de ventilation ça passe.
Mes collègues de travail utilisent du xylol, alors!


Encore une toute toute petite question : auriez-vous un avis ou une suggestion à me faire quant aux choix des temps utilisés dans la procédure de fixation-enrobage et inclusion?

Je ne connais pas le traité de microscopie de Langueron (je suppose qu'il s'agit d'un ouvrage de référence français!) Savez-vous de quand date la dernière édition?

Ce forum est vraiment sympa....

[JPL]

Envoyé par BrigitteS

D'après votre expérience, n'observerait-on pas plutôt des désordres dans la morphologie des cellules à l'observation des coupes colorées plutôt que des fissures extracellulaires (si le fixateur a provoqué des contractions au moment de la fixation)?

Désordre dans la morphologie cellulaire, probablement. Les fissures pourraient être dues au fait que les contractions mettent le tissu sous tension et que le passage dans les divers alcools puis le paraplast accentuent le phénomène. Les fissures se formeraient secondairement dans le tissu sous tension au moment où il est devenu cassant. Mais tout ceci n'est qu'hypothèse. De toutes façons vous avez intérêt à travailler avec les pièces les plus petites possibles, mais on n'en est pas maître lorsqu'on veut étudier un organe entier par exemple.

Envoyé par BrigitteS

Encore une toute toute petite question : auriez-vous un avis ou une suggestion à me faire quant aux choix des temps utilisés dans la procédure de fixation-enrobage et inclusion?

C'est vrai que cette durée m'a surpris. La pièce a tout le temps de durcir. Quelle est la taille des pièces et la consistance des tissus ?

Envoyé par BrigitteS

Je ne connais pas le traité de microscopie de Langueron (je suppose qu'il s'agit d'un ouvrage de référence français!) Savez-vous de quand date la dernière édition?

Ce forum est vraiment sympa....

Oh, c'est un très vieux souvenir : c'était le livre de "recettes de cuisine" en histo à l'époque où je faisais ça, et il datait déjà beaucoup mais était très précieux. J'ai trouvé sur le web trace d'une édition en 1949 (Précis de microscopie, chez Masson). Il semble avoir été repris sous le titre Manuel de microscopie par Locquin et Langeron (mais Langeron devait être mort à ce moment là).
PS : le fixateur de Duboscq-Brasil doit être préparé juste avant l'emploi. En effet en vieillissant il se produit une estérification de l'alcool par l'acide acétique (l'odeur de l'acétate d'éthyle est perceptible dès le lendemain). Le labo dans lequel j'étais entré ne prêtait pas attention à ce point et mes premiers résultats étaient irréguliers pour cette raison. C'est le nez qui m'a permis de comprendre ce qui se passait.

PS n° 2 : merci pour le forum sympa !

[BrigitteS]

Re

C'est vraiment très sympa à vous de me faire part de votre expérience.

J'ai lu dans 2 livres de techniques histologiques qu'il n'était pas nécessaire de préparer le fixateur D.-B. au dernier moment si on ajoutait l'acide acétique au moment de l'emploi (?)

Je conclue qu'il ne faut pas laisser séjourner les tissus trop longtemps dans ce fixateur mais je n'ai pas trop le choix à cause des étapes du temps de réception du matériel, de la dissection, des prises de vue etc....
Je vais aussi essayer de modifier les temps de deshydratation et de solvant et on verra le résultat.

Je ne sais pas si la fixation au bouin aqeux me permettrait de garder les tissus embryonnaires (4-5mm)un petit peu plus longtemps que celle dans le D.-B, tout en évitant le durcissement du tissu ??

Il n'y a pas beaucoup de nouvelle littérature sur les techniques utilisées en laboratoires mais maintenant on a internet qui peut s'avérer une excellente source d'informations (et oui! même les forums)

[JPL]

En effet il suffit d'ajouter l'acide acétique au dernier moment. Je pense que le Bouin ou le Bouin-Hollande sont des fixateurs un peu plus doux. Je pense aussi qu'on peut réduire le temps passé dans le Paraplast (en divisant par 2 pour commencer avec une pièce qui ne risque rien). C'est quoi comme embryons ?
Ceci étant dit, c'est vrai qu'on travaille avec des recettes qui remontent pour certaines au XIX siècle ! Bouin a mis au point son fixateur pour une étude des testicules qui a été publiée en 1903 ou 1904 !

[BrigitteS]

Re

Et bien çà date!

Ce sont des embryons entiers de poulet de 4 jours (4-5mm)

Pour quelles raisons me proposez-vous une diminution du temps dans le paraplast (ce serait l'étape à modifier en premier dans mon protocole avant le choix d'une diminution du temps de deshydratation ou du temps dans le solvant?)

[JPL]

Cela fait une éternité que je n'ai pas fait d'histo, et dans ce domaine il n'y a pas de certitude, rien que des tâtonnements et regarder si ça change quelque chose. Dans cette optique j'aurais tendance à diminuer le temps de séjour à température élevée d'autant qu'à cet âge ces embryons sont très minces et doivent être imprégnés assez facilement. Mais tout ce qui diminue également le temps de séjour dans les solvants est également souhaitable.
Avec tout ma sympathie : moi, c'était des embryons d'insecte.

[BrigitteS]

Merci JPL et peut-être à plus sur un forum.