Conséquence de la concentration d'un tampon électrophorèse sur l'intensité

Patati · 13/04/2006, 12h59

Bonjour à celui ou celle qui voudra bien éclairé ma lanterne....

Je dois réaliser une électrophorèse d'adn pour démo lors d'un tp. Pour ce faire j'utilise un kit "tout prêt d'ADN de saumon et de lambda digérés ". Il suffit, selon la notice, de diluer le tmpon TBE 10 X , et d'appliquer pendant 45 min à 1 heure 90-100V.
Pas de problème alors? et bien si!
Mon alimentation est limitée à 30 mA; je n'rrive ps à envoyer une tension supèrieure à 50Volts... la migration trop longue se termine après la fin de l séance de tp...!
Après conseils auprès d'un physicien, j'ai essayé en diluant le tampon TBE 20 X .... Alors là c'est pire l'alim disjoncte immédiatement!
Que faire??Ilme semblait pourtant qu'en diminuant la concentration du tampon, j'augmentais sa résistance et donc diminuais l'intensité pour une meme tension....

Quand la physique se mêle à la biologie....

Merci de votre aide

Annaick_R · 13/04/2006, 13h54

Bonjour,

il y a un truc qui me chiffone un peu :
tu dis "diluer le tampon TBE 10 X" et "en diluant le tampon TBE 20 X"

Or, pour moi, le TBE 10X et 20X, ce sont des tampons 10 et 20 fois plus (+) concentré que le TBE 1X (de référence). Alors je ne comprends pas comment tu peux diluer du TBE 10X en TBE 20X.

Sinon, la séparation des bandes dans l'ADN dépend de la concentration d'agarose : plus l'agarose est dilué, plus les petites molécules d'ADN vont migrer vite. Ca peut peut-être réduire la résistance totale du circuit!

Qu'est-ce que tu veux montrer avec ton gel ?

Annaïck.

Patati · 13/04/2006, 14h28

Le kit utilisé permet simplement de montrer l'action des enzymes de restriction aux élèves de terminales S. L'alimentation utilisée est, selon le fournisseur, étudiée spécialement pour réaliser ce type de gels. J'imagine donc que c'est un problème de tampon....

En fait le tampon livré avec le kit est 10 X concentré.
Je l'ai utilisé une première fois en le diluant au dixième * soit TBE 1X) mais mon courant était limité à 50V pour 25 mA.
Pour obtenir une tension de 90 V j'ai dilué le tampon concentré 10X (fourni avec le kit) au 20ème(conctration finale 0.5X TBE) Avec cette nouvelle concentration l'alimentation limitée à 30mA disjontait immédiatement!

J'espère avoir été plus claire.

Annaick_R · 14/04/2006, 11h17

Mes électrophorèses se déroulent dans un tampon à 0,5X (10X dilué au 1/20e).
Je laisse la migration se faire pendant 20 min à 50 V.
Mais c'est un mini-gel (5cm x 5cm x 5mm).

Tu as fait un essais d'électrophorèse d'1h à 50V ?
En une heure, tu devrais pourvoir faire migrer l'ADN sur 10-15 cm. Ca devrait être suffisant pour montrer la restriction de l'ADN.
Si je me souviens bien, quand on digère de l'ADN génomique par une enzyme de restriction, on obtient une traînée (ou "smear" en anglais) après l'électrophorèse et coloration du gel.

As-tu branché les bornes de l'alimentation dans le bon sens ? l'ADN est chargé négativement, il migre vers le pôle +. Ca m'est arrivé d'inverser le sens du branchement et évidemment, à la fin, il n'y a plus rien.

A quelle concentration d'agarose est ton gel ?
je partirai sur du 0,6-0,8% (=0,6-0,8 mg agarose/100 mL) voir même 0,5% pour bien étirer le "smear".

neferesis · 14/04/2006, 21h55

Salut!
Je suis d'accord avec Annaick_R. Essaye du tampon 1x ou 0.5x avec une concentration d'agarose de 0.8% sur un petit gel, voir même 0.6% comme dit plus haut. Ton kit de lambda digéré c'est un vecteur c'est bien ça? Donc s'il est digéré tu devrais voir une bande assez haut sur ton gel (dans les 2kb environ) et tu peux laisser migrer moins longtemps...

**Yoyo** · 15/04/2006, 10h33

une autre petite question "bete", mais quand tu as dilué au 20eme ton TBE, as tu pensé a utilisé une solution de TBE 0.5X pour faire ton gel aussi?

Yoyo

nayeki · 15/04/2006, 19h21

Patati, solution plus pragmatique et realiste: tu lances ta migrations avant le debut du TP pour qu'ils voient le resultat, un 2eme gel pdt le TP pour leur montrer aussi cette etape

Sinon, abaisser la concentration d'agarose a 0.8 ou 0.6 (attention ca fond tres rapidement...) ou changer ton marqueur, certains donne des bandes a 100pb puis 200, 300 etc, pas besoin de migrer bcp pour voir un resultat.

Patati · 18/04/2006, 14h31

Bonjour!

Merci pour tous ses renseignements! J'ai fait un nouvel essai; nouveau tampon dilué 10X, nouveau gel à 0.8%, mais cette fois-ci j'ai inséré un rhéostat pour limiter le courant.... Une heure de migration et le résultat était plutôt bon!!

Conclusion: cela devait etre juste un problème d'alimentation !!!