Différence RT_PCR semi-quantitative et Q-PCR

Sophie_C · 25/04/2006, 17h17

Bonjour, j'effectue des recherches sur la différence entre la RT-PCR semi-quantitative et la Q-PCR.
Jusqu'à présent j'ai trouvé que la Q-PCR était plus sûre, plus rapide, avait une grande sensibilité et pouvait permettre de travailler sur plusieurs cibles dans la même analyse. J'aurais souhaité savoir qu'elles étaient les avantages de la RT semi quantitative.
Merci d'avance.

Toll · 26/04/2006, 07h45

bonjour,

quand tu dis que la Q-PCR est plus sûr, je mettrai quand même un petit bémol.

la PCR quantitative (et vraiment quantitative) se doit d'être réalisée avec la plus grande prudence tant au niveau de l'expérimentation qu'au niveau de l'analyse des datas pour pouvoir dire le nombre exact de copies que tu as dans ton extrait.

pour ce qui est de la RT-PCR semi-quantitative, cette dernière est beaucoup plus rodée, et suffit dans la majorité des cas lors d'études de l'expression et de la variation de l'expression de gènes (quantification relative et non absolue).

de plus avec la RT-PCR semi-quantitative, il est aussi possible d'analyser plusieurs cibles en même temps.

Sophie_C · 26/04/2006, 11h55

Merci pour ces renseignements. Ca commence à ce mettre en place !

AlineG · 03/08/2006, 13h55

Bonjour,

La RT-PCR semi quantitative permet donc bien de voir la variation de l'expression d'un gène?
a partir de quelle variation le résultat est significatif?
Est-ce que vous savez combien d'ARN et, à fortiori, combien de cellules il faut pour réaliser une RT-PCR semi quantitative?

Toll · 03/08/2006, 21h43

Citation:

Posté par AlineG

Bonjour,

La RT-PCR semi quantitative permet donc bien de voir la variation de l'expression d'un gène?
a partir de quelle variation le résultat est significatif?
Est-ce que vous savez combien d'ARN et, à fortiori, combien de cellules il faut pour réaliser une RT-PCR semi quantitative?

variation de l'expression: OUI
avec en référence un gène dont l'expression ne varie pas (actin, GAPDH,....)

significativité: il faut au moins 2 cycles de différence pour être sur de voir une réelle différence et non un artéfact de manip. Car comme on bosse en Log(10), la moindre petite varation peut donner un faux positif.

quantité de matos: ben là, tout dépend sur quoi tu bosses. cela dépend du type cellulaire utilisée, du gène étudié,.... à voir avec les publications déjà parues, sinon faut tester....

AlineG · 07/08/2006, 10h18

Merci beaucoup...
Je vais m'y mettre très bientôt! Je vais dès maintenant potasser mes publis...

maman54 · 30/09/2006, 16h44

bonjour,je suis toute nouvelle dans le forum et je suis un peu perdu concerant la difference entre cpr semi quantitative!!!
et ce que veux dire serie de double dilution!!!
j'ai vraiment besoi de reponse merci

Lord M · 26/03/2007, 16h22

Bonjour,

Je relance ce fil car je dois bientôt me lancer dans la RT-PCR en temps réel afin de visualiser les différences d'expression d'un gène chez une bactérie dans différentes conditions de croissance.

Quelques questions si il y a des spécialistes dans la salle :
- il faut un gène de référence pour cette manip. Sachant que je ne connais rien du génome de ma bactérie, existe t'il des gènes rapporteurs "universels" que je pourrais utiliser ?
- pour l'extraction des ARNm : est il possible de conserver les culots de cellules pendant quelques semaines à -80°C avant de faire l'extraction ou cela risque t'il d'abimer les ARN ?

Merci d'avance

sacharybalka · 26/03/2007, 16h45

Salut! j'ai réalisé quelques RT-RT -PCR (reverse et real time, en une seule manip) durant un stage que je viens juste de terminer (j'ai même pas encore tous mes resultats)
On étudiait l'expression de recA chez les bactéries du sol. En théorie il aurait fallu utiliser l'ARN de recA dont on connaîtrait la concentration, mais comme on n'avait pas les bactéries en culture, nous avons utilisé le 16S des bactéries en question.
Voilà. On a eu quelques pb de contamination, apparemment il faut vraiment faire attention à tout.
Bonne chance

Lord M · 26/03/2007, 17h05

Salut,

Tu veux dire que tu as utilisé le gène de l'ARNr 16S en temps que gène de référence ?

sacharybalka · 26/03/2007, 17h19

Re-salut!
oui, je crois que son niveau d'expression change lors du cycle cellulaire, mais statistiquement sur le total de mes cellules il doit rester stable.
Comme ça en fait je peux relier le "nombre de copies" de cet ARN au nombre de bactéries de cette espèce dont j'ai extrait l'ARN.
Et ainsi avoir le niveau d'expression de l'ARNm de recA.
Oui mon pb était de travailler sur le sol directement, je ne sais pas si les bactéries de cette espèce ont proliféré ou au contraire sont toutes mortes (j'ai pollué le sol).

Grâce au 16S je pouvais me liberer de ce pb

Lord M · 27/03/2007, 09h56

Oki, merci

Sinon, personne ne sait si je peux congeler mes culots de cellules sans risque pour leur ARN ?

Toll · 27/03/2007, 10h27

Citation:

Posté par Lord M

Oki, merci

Sinon, personne ne sait si je peux congeler mes culots de cellules sans risque pour leur ARN ?

bonjour,

il m'arrive qd je suis un peu la bourre dans les manips, de congele (-80°C)r mes cellules dans le tampon d'extraction utiliser lors de la purification d'ARN (tampon RLT du kit RNeasy de chez qiagen).

pas de probleme ensuite pour reprendre la suite de la manip.
je n'ai pas noter de différence notable dans la quantité d'RNA obtenus.

toll

Lord M · 27/03/2007, 10h50

Merci beaucoup ! Je vais voir si j'ai de ce tampon en stock

gorben · 27/03/2007, 17h05

Salut,

Au niveau du gene de menage, basiquement j'utilisais l'ARNr 16S, gyrA, thiC ou rpoC.

Evidemment, aucun gene n'est parfait. Le probleme de l'ARNr 16S, c'est que ta cellule en est pleine ! Du coup quand tu rapportes ton gene d'interet sur le gene de ref, tu ecrases tes valeurs et tu passes a cote de legeres variations, ce qui est dommage etant donne que c'est le but premier de la methode !
2 eme probleme avec 16S, si tu etudies l'expression de ton gene en differente condition de croissance, il y a fort a parier que la vitesse de croissance soit differente, ce qui fais que ton niveau de reponse style ppGpp dans la cellule est different, et donc [l'ARNr 16S] est differente entre tes echantillons...
Je pense que thiC etait assez specifique a ma bacterie, en ce qui concerne gyrA et rpoC, le niveau d'expression est plus faible que 16S, mais comme 16S ils sont regules par la vitesse de croissance...

Sans vouloir te demoraliser, tu es dans les pires conditions pour faire de la RT-PCR "vraiment" quantitative. Ne lesine pas sur la mise au point, surtout en ce qui concerne la relation entre ton gene de menage "stable" et la vitesse de croissance de tes cellules !

Pour les culots a -80, oui tu peux les congeler dans du RNA later. Par contre je ne les garde pas plus d'un mois.

A+

Lord M · 27/03/2007, 17h20

Salut !

Merci pour les précisions sur les gènes de ménage.

L'avantage du gène du 16S c'est que je connais sa séqence . Mais sinon j'ai lu qu'il était possible d'utiliser un gène de la chaine fermentaire (de la synthèse du lactate plus précisément).

Je n'avais pas pensé que l'expression des gènes de ménage pouvait être influencée par la température de croissance, mais c'est logique. Encore un paramètre en plus qu'il va falloir surveiller :'(

gorben · 27/03/2007, 17h31

Si tes "differentes conditions de croissance" font uniquement reference a un changement de temperature, les variations seront la, mais nettement moins importantes que dans le cas d'une carence !!! C'est un moindre mal