reconstitution et dilution des amorces

[invite023b29be]

on a eu le rapport synthétique des amorces (lyophilysés),la quantité est de 132.5nM et la la concentraion des amorces dans la pcr kon va faire est de 100microM

comment on va faire pour les reconstituer et les diluer?
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[piwi]

Je pense plutot que votre protocole indique de mettre X µl d'une solution stock d'oligo à 100µM. Classiquement, les oligos sont à 2 pM final dans le mix PCR. 100µM c'est énorme!

[Cendres]

Au fait: Bonjour!

[invitee170a0e7]

Je pense plutot que votre protocole indique de mettre X µl d'une solution stock d'oligo à 100µM. Classiquement, les oligos sont à 2 pM final dans le mix PCR. 100µM c'est énorme!

Oui je pense aussi qu'il y a une coquille...

Pour calculer le volume d'eau (ultrapure autoclavé) à ajouter dans le tube "stock" (classiquement, comme l'a précisé piwi, à 100µM final), il existe plusieurs moyens :
- Par la DO
- Par la masse
- Par la molarité
et probablement d'autres moyens ^^

Je te conseilles de regarder la feuille de synthèse. Normalement tu devrais avoir tout les renseignements nécessaire pour faire ton stock d'amorces à 100µM. Ensuite libre à toi de faire des dilutions comme tu le souhaite (tubes amorces "filles"), par exemple à 5 ou 10µM

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite023b29be]

merci beaucoup

[invite0a3fba27]

Oui je pense aussi qu'il y a une coquille...

Pour calculer le volume d'eau (ultrapure autoclavé) à ajouter dans le tube "stock" (classiquement, comme l'a précisé piwi, à 100µM final), il existe plusieurs moyens :
- Par la DO
- Par la masse
- Par la molarité
et probablement d'autres moyens ^^

Je te conseilles de regarder la feuille de synthèse. Normalement tu devrais avoir tout les renseignements nécessaire pour faire ton stock d'amorces à 100µM. Ensuite libre à toi de faire des dilutions comme tu le souhaite (tubes amorces "filles"), par exemple à 5 ou 10µM

ahhh je me perds ... et pourtant ça ne doit pas être compliqué !!
mon problème à moi ce n'est pas la dilution mais plutôt la reconstitution des oligo.
Mes oligo sont à 51,6nM et j'ai 490 ng il faut que je les reconstitue pour les avoir à 100 uM !! avant de les diluer pour faire ma PCR qui elle sera à 10uM en oligo. çe ne me pose pas problème ça puisque dans mon volume total de 50 ul je mets 5ul d'oligo à 100 uM.
Cependant je n'arrive pas à trouver le volume d'eau que je dois ajouter à mes oligo de 51,6nM lyophilisés pour les avoir à 100uM ... est ce que vous pouvez m'aider svp

Merci à vous !

[piwi]

Ce ne sont pas 56 nM que vous avez, écrit comme cela c'est une concentration. Ce que vous avez est 56 nmoles, c'est à dire une quantité. c=q/v avec c la concentration, q la quantité, et v le volume. Vous vous prenez la tête pour rien ^_^

Cordialement,
piwi

[invite0a3fba27]

Ce ne sont pas 56 nM que vous avez, écrit comme cela c'est une concentration. Ce que vous avez est 56 nmoles, c'est à dire une quantité. c=q/v avec c la concentration, q la quantité, et v le volume. Vous vous prenez la tête pour rien ^_^

Cordialement,
piwi

merci pour ta réponse piwi ... effectivement j'ai revérifié avec ton explication et c'est marqué 51,6nMol
Si je dois calculer le volume d'eau à ajouter pour avoir 100uM (V=q/c) est ce que 100uM serait la concentration ?!! mais ça m'étonnerait que ça soit 0,5ul d'eau !!
et si 51nMol est la quantité que représente 490ng ?!!

Merci beaucoup de prendre le temps de me répondre ... je m'embrouille un peu je débute

[piwi]

Bonjour, sans vouloir vous offenser, j'ai l'impression que vous êtes un peu fâchée avec la chimie élémentaire
Vous voulez votre oligo à 100µM c'est à dire à 100µmoles/L c'est à dire à 100nmoles/mL. On pousse un petit peu plus loin le vice et on voit qu'il vous fait 1nmole/10µL. Vous en avez 51.6, il vous faut 516µL.

Cordialement,
piwi

[invite0a3fba27]

Bonjour, sans vouloir vous offenser, j'ai l'impression que vous êtes un peu fâchée avec la chimie élémentaire
Vous voulez votre oligo à 100µM c'est à dire à 100µmoles/L c'est à dire à 100nmoles/mL. On pousse un petit peu plus loin le vice et on voit qu'il vous fait 1nmole/10µL. Vous en avez 51.6, il vous faut 516µL.

Cordialement,
piwi

j'avais omis quelques zero lors de la conversion parce que je croyais que c'était 100 uMoles/ul !!
Merci beaucoup d'avoir pris le temps de m'expliquer avec patience

[Edelweiss68]

j'avais omis quelques zero lors de la conversion parce que je croyais que c'était 100 uMoles/ul !!
Merci beaucoup d'avoir pris le temps de m'expliquer avec patience

Juste pour que ce soit clair quand on écrit mM cela se lit "milimolaire", µM = micromolaire, nM = nanomolaire ...etc

Et dans tous les cas où vous voyez écrit "...molaire" cela signifie qu'il s'agit d'une concentration (et non pas d'une quantité) en ... par litre de solution.

[invite0a3fba27]

Juste pour que ce soit clair quand on écrit mM cela se lit "milimolaire", µM = micromolaire, nM = nanomolaire ...etc

Et dans tous les cas où vous voyez écrit "...molaire" cela signifie qu'il s'agit d'une concentration (et non pas d'une quantité) en ... par litre de solution.

Merci beaucoup pour ces précisions ... je voyais pas la nuance, et ça m'a faussé le calcul !

[Edelweiss68]

Merci beaucoup pour ces précisions ... je voyais pas la nuance, et ça m'a faussé le calcul !

Et bien maintenant vous ne vous tromperez plus !

[invite75678891]

bonjour, je suis nouveau sur le forum, j'ai lu tous vos commentaires, le truc ce que moi, j'ai des amorces pol is 4B, et pol ORB? avec pour nombre de mol respectif 23.9nmol et 22.0nmol, mais en calculant la concentration de la solution mère je ne me retrouve pas, j'ai fais des dilutions au 1/10, mais rien, avez vous des idées à ce sujet?

[Loupsio]

bonjour, je suis nouveau sur le forum, j'ai lu tous vos commentaires, le truc ce que moi, j'ai des amorces pol is 4B, et pol ORB? avec pour nombre de mol respectif 23.9nmol et 22.0nmol, mais en calculant la concentration de la solution mère je ne me retrouve pas, j'ai fais des dilutions au 1/10, mais rien, avez vous des idées à ce sujet?

Techniquement sur le rapport de synthèse tu as la quantité d'eau à ajouter pour obtenir une concentration de 100 pM, il suffit d'ajouter cette quantité, ensuite tu peux te faire une solution diluée a partir de cette solution stock (dilution au 1/10eme c'est bien afin d'avoir des primers à une concentration de 10 pM) et c'est cette solution que tu utilisera pour tes PCR, après tout depend de la quantité d'amorce que tu veux utiliser par réaction PCR et le volume reactionnel que tu utilise mais si tu n'es pas a l'aise avec les calculs utilise le bon vieux
C1*V1=C2*V2
V1=(C2*V2)/C1

[Lissa]

Bonjour. S' il vous plaît, j' ai un solution des amorce BTV 125 nmol combien d' eau ajouter pour trouver un solution de travail final 10micromol/l