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Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.



  1. #1
    Vinc

    Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut!

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1...ubmed_RVDocSum


    Creation of human tumour cells with defined genetic elements.

    (Hahn et al. Nature, 1999)

    Ce travail est issu du laboratoire de Bob Weinberg au MIT, célèbre (entre autre) pour avoir découvert la mutation Ras V12 au milieu des années 80, et plus globalement pour être certainement le chercheur ayant le plus apporté à la cancérologie au cours des deux dernières décennies (même s’il n’est pas le seul, il reste incontournable). Cette publication plus tardive (1999) s’est très rapidement imposée comme étant une, si ce n’est LA, publication essentielle de la cancérologie moléculaire humaine. C’est la première étude qui a permise de « créer » une cellule cancéreuse humaine à partir d’une cellule humaine normale et surtout, à partir d’éléments génétique bien définis. Le raisonnement, comme beaucoup d’études de gros labos américains, est d’une simplicité et d’une clarté déconcertante à tel point que l’on se demande pourquoi personne n’y avait pensé avant eux (la simplicité est cependant uniquement apparente la plupart du temps et cache souvent de grosses difficultés techniques).

    Le principe fonctionne par ajout d’éléments oncogéniques en observant l’effet de ces éléments sur certaines caractéristiques des cellules. Ainsi, deux oncogènes ont été utilisés soit séparément, soit ensemble : H-Ras G12V (H-Ras) et la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT). Deux lignées principales ont été utilisées pour cette étude : les HEK (Human Embryonic Kidney) et les BJ (human fibroblasts). Les cellules sont initialement modifiées par l’antigène T du SV40 qui ne permet pas de les immortaliser mais simplement de passer outre la sénescence (conditions indispensables pour la survie des cellules non immortalisées en culture).

    Ce travail peut-être divisé en deux grandes parties.

    La première partie de l’étude consiste à introduire les différents éléments dans les cellules HEK et BJ afin d’obtenir différentes lignées possédant H-Ras V12 et/ou Htert avec toutes les combinatoires possibles (-/-, - /+, +/- et +/+). Les expressions de l’Ag T et de H-Ras sont vérifiées par western-blot. L’ajout de la télomérase est validé par RT-PCR et son activité est contrôlée par southern-blot. Les télomères sont allongés dans les cellules modifiées par rapport aux cellules témoins.

    La seconde partie du papier est dédiée à l’analyse des propriétés des différentes lignées créées.
    Les auteurs réalisent tout d’abord des essais de prolifération en absence de substrat, propriété essentielle des cellules cancéreuses. La méthode utilisée est robuste et largement reconnue pour ce type d’expérience : les cellules sont cultivées dans de l’agar mou (ce qui pour la cellule, correspond à une absence de substrat) et les colonies formées sont comptées. Les résultats de cette première expérience sont nets : seules les cellules qui possèdent à la fois H-Ras et hTERT sont capables de former des colonies dans l’agar. Ce résultat est valable pour les cellules HEK et BJ. Cependant, une petite partie des cellules HEK possédant uniquement H-Ras mais sans la télomérase sont capables de proliférer dans l’agar.
    La figure suivante est consacrée à la prolifération des cellules en culture. Seules les cellules immortelles sont capables de proliférer en culture et l’immortalité est également une caractéristique essentielle des cellules cancéreuses. Les auteurs suivent l’évolution de la population sur 125 jours. Là encore le résultat est impeccable : seules les cellules possédant la télomérase sont capables de proliférer en culture. Le statut de Ras n’a aucune influence sur cette prolifération ce qui indique que Ras ne joue pas de rôle majeur dans l’immortalisation des cellules. La double possession de l’Ag T et de la télomérase confère donc l’immortalité aux cellules.
    La dernière figure intéresse la transformation tumorale en elle même (après avoir étudié l’immortalisation) et teste la capacité des différentes lignées à former des tumeurs in vivo chez la souris nude immunodéficiente. Les cellules HEK sont donc injectées dans les souris et le volume des tumeurs formées est mesuré régulièrement. Les souris sont sacrifiées lorsque la tumeur dépasse 1 cm de diamètre. Seules (et toutes) les souris à qui l’on a injecté des cellules positives pour H-Ras et hTERT développent des tumeurs.

    Les auteurs concluent que l’expression ectopique de l’antigène T, de H-Ras G12V et de hTERT suffit pour convertir une cellule normale en une cellule tumorigène. C’est la première tentative réussi de transformation tumorale dans une cellule humaine.
    Il faut toutefois signaler qu’une équipe avait déjà tenté l’expérience en transfectant des fibroblastes humain avec E6/E7 (qui inactivent Rb et p53, donc qui miment l’Ag-T), hTERT et Ras mais sans succès. Ceci est paradoxal avec les résultats de Weinberg dans la mesure où les mêmes voies sont sensées être stimulées ou inactivées dans les deux cas. Weinberg explique la différence par le fait que l’Ag-T, outre l’inactivation de Rb et p53, perturbe également d’autres pathways (contrairement à E6/E7) et suppose donc que parmi ces autres voies certaines doivent être altérées pour que la transformation tumorale se fasse….


    V.

    -----

    Dernière modification par piwi ; 06/02/2009 à 17h43.
    Primum non nocere.

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  3. #2
    gorben

    Re : Liste de journal club

    Salut,

    Bravo pur l'effort. Je trouve ca bien ecrit, bien introduit et clair.

    J'ai deux questions naives.
    1/ Est ce que le choix du type cellulaire a ete dicte par un interet special, ou c'est juste deux types de cellules qu'ils avaient sous la main?
    2/
    Les résultats de cette première expérience sont nets : seules les cellules qui possèdent à la fois H-Ras et hTERT sont capables de former des colonies dans l’agar. Ce résultat est valable pour les cellules HEK et BJ. Cependant, une petite partie des cellules HEK possédant uniquement H-Ras mais sans la télomérase sont capables de proliférer dans l’agar.
    Le statut de Ras n’a aucune influence sur cette prolifération ce qui indique que Ras ne joue pas de rôle majeur dans l’immortalisation des cellules. La double possession de l’Ag T et de la télomérase confère donc l’immortalité aux cellules.
    C'est moi qui ai rien compris ou est ce qu'il y a contradiction?

    Il semble donc que l'Ag T et hTERT soient suffisants pour conferer l'immortalite aux cellules. Qu'en est t'il de vTERT? Est ce qu'ils ont verifie apres infection par SV40 de ne pas avoir ajoute un vTERT?

    A+

  4. #3
    piwi

    Re : Liste de journal club

    Je suis désolé mais j'ai en ce moment un séminaire à préparer... Meiose, histones, youpi troulala...
    Pas trop la tête à faire beaucoup de rab'. J'ai quand même survolé le texte mais j'en ai pas resorti grand chose comme commantaire. J'ai quand même la même question que gorben. Pourquoi ces cellules?

    Sinon je pense que tu peux quand même faire une planche avec les figures clés. Ca doit bien rentrer dans le cadre de la loi.

    Je repasse dés que j'ai la tête à faire de la cancéro
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    Vinc

    Re : Liste de journal club

    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    1/ Est ce que le choix du type cellulaire a ete dicte par un interet special, ou c'est juste deux types de cellules qu'ils avaient sous la main?
    Je n'ai pas de réponse (j'ai vu Weinberg en conférence il y a une semaine et n'ai pas pensé à lui poser la question ). Je suppose que c'est en rapport avec le bon taux de transfection de ces cellules.


    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    2/
    C'est moi qui ai rien compris ou est ce qu'il y a contradiction?
    Oui absolument c'est contradictoire. Je pensais développer en conclusion mais j'ai changé d'avis pour "piquer la curiosité du lecteur"
    Les auteurs expliquent que ces colonies formées par les cellules possedant uniquement Ras et T sont très minoritaires (en réalité on en trouve 40 contre 160 pour les cellules double + pour Ras et hTERT) et beaucoup plus petites. Ils nous rassurent également en signalant que ces cellules sans hTERT ne forment pas de tumeurs chez la souris. Et enfin ils supposent que les clones qui apparaissent sans hTERT dans l'agar sont (je cite) "one manifestation of replicative mortality that occurs in the absence of telomere maintenance"...
    En fait il a été montré en 2004 dans un journal plus modeste que la télomérase n'est pas nescessaire à l'obtention de cellules tumorales humaines et que seuls Ras et AgT suffisent (dans des cellules adrénocorticales humaines) même si les cellules rentrent rapidement en crise (et donc la tumeur ne grossit pas beaucoup). Je ne sais pas si ce papier a été remis en question ou pas.
    Par contre il a ensuite été montré que l'Ag-T augmente l'activité de la télomérase ce qui pourrait également expliquer ce résultat bizaroïde (mais ce "détail" n'était pas connu lorsqu'ils ont publié le Nature).


    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    Il semble donc que l'Ag T et hTERT soient suffisants pour conferer l'immortalite aux cellules. Qu'en est t'il de vTERT? Est ce qu'ils ont verifie apres infection par SV40 de ne pas avoir ajoute un vTERT?
    A ma connaissance le SV40 a un génome circulaire, il n'a pas de télomères "donc" ne possède pas la télomérase et vTERT n'existe pas...

    V.
    Primum non nocere.

  6. #5
    Vinc

    Re : Liste de journal club

    Je voulais rajouter (mais les 5 minutes réglementaires d'édition ont été un peu courtes.... grrrrrr) qu'en ce qui concerne l'activation de la télomérase par l'Ag-T, il n'y a pas sur le northern qui teste la télomérase d'étude sur les cellules sans l'Ag-T donc on ne peut pas savoir s'il y a un allongement avec AgT seul sans hTERT... Cela aurait-été particulièrement intéressant d'avoir ce contrôle ce qui aurait en même temps permis à Weinberg de sortir un autre gros papier sur l'activation de hTERT par T

    V.
    Primum non nocere.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    gorben

    Re : Liste de journal club

    A ma connaissance le SV40 a un génome circulaire, il n'a pas de télomères "donc" ne possède pas la télomérase et vTERT n'existe pas...
    Ok, j'avais une copine qui bossait sur Marek, et justement le virus arrivait avec son propre vTR qui complementait cTR. Je pensais naivement que tous les virus oncogene avaient une telomerase.

    Few more questions :

    1/ Est ce qu'il y a d'autres associations bien connues d'oncogene mis a part RAS et TERT? D'autres equipes ont elles essaye la meme approche sur d'autres oncogenes?

    2/ Est ce que la telomerase est toujours necessaire pour l'immortalisation?

    3/ Est ce que quelqu'un a deja essaye de mettre plus de deux ou 3 oncogenes dans une cellules? Est ce que la cellule survie a un dereglement complet?

    A+

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  10. #7
    Vinc

    Re : Liste de journal club

    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    1/ Est ce qu'il y a d'autres associations bien connues d'oncogene mis a part RAS et TERT? D'autres equipes ont elles essaye la meme approche sur d'autres oncogenes?
    En fait comme je l'ai signalé dans un de mes précédents messages il y a eu un essai non concluant en cellules humaines mais sans l'AgT. Sinon l'expérience a été réalisée dans des cellules murines NIH3T3 en 1983 (toujours par Weinberg) en utilisant Ras et soit myc soit l'Ag-T. L'expérience a donc été reproduite en 1986 en cellules humaines avec Ras et l'Ag-T mais sans succès.
    Pour ce qui est des coopérations d'oncogènes, si l'on se place dans un cadre général oui bien entendu il y a de nombreux pattern d'expression/silencing entre oncogènes et suppresseurs de tumeurs dans les cancers. 90% des cancers du pancréas ont une mutation activatrice de Ras alors que pour les hémopathies malignes c'est beaucoup plus faible ou non observé. Les oncogènes et suppresseurs de tumeurs concernés sont très type cellulaire dépendant.

    Ce qui est, à mon sens, fondamental dans cet article, outre le fait que la tentative a fonctionné, c’est qu’il montre bien les deux étapes majeures : l’immortalisation dans un premier temps puis la transformation tumorale proprement dite qui ne peut pas avoir lieu sans l’immortalisation. Le corolaire de tout ça étant qu’une cellule immortelle n’est pas une cellule tumorale.


    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    2/ Est ce que la telomerase est toujours necessaire pour l'immortalisation?
    A priori je dirai oui (sans bien connaitre le sujet). La télomérase doit avoir une activité, après qu'elle soit directe par surexpression ou par ajout d'un élément qui l'active (Ag-T)... Mais lorsqu'on lit le papier on voit que la surexpression est plus efficace que l’Ag-T car les cellules sans hTERT ne donnent pas de tumeurs.

    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    3/ Est ce que quelqu'un a deja essaye de mettre plus de deux ou 3 oncogenes dans une cellules? Est ce que la cellule survie a un dereglement complet?
    Je ne sais pas mais de toute façon en mettant Ag-T, Ras et h-TERT finalement on active plus de 3 voies puisque Ag-T va activer d'autres éléments.
    Au niveau de la survie je dirai que les cellules cancéreuses sont par définition des cellules très dérégulées avec parfois d'innombrables remaniements mais ça fonctionne parce que l'apoptose est défectueuse, parce que la cellule répare ses télomères et by-pass les systèmes de contrôles. Si l'on s'amusait à faire un caryotype d'HeLa je suis sûr qu'on trouverait peut-être 100 ou 200 chromosomes avec des réarrangements dans tous les sens. C'est ce que l'on observe pour les sarcomes à génétique complexe. Le génome de certaines cellules tumorales n'a plus grand chose à voir avec un génome humain standard.
    La cellule rebâtit ses réseaux de signalisations à partir des protéines clef endommagées. C'est d'ailleurs pour cela qu'en ciblant ces éléments on a de bonnes chance d'éliminer la cellule.

    V.
    Primum non nocere.

  11. #8
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Bonjour à tous les membres de notre forum biologie.
    Nous sommes heureux de vous offrir cette nouvelle rubrique d'analyse de papiers scientifiques. Il s'agit d'un exercice classiquement proposé dans les laboratoires de recherche. Il permet d'ouvrir la curiosité, de découvrir de nouveaux aspects méthodologiques et conceptuels. Il permet aussi, et peut être surtout, de discuter et de confronter sa vision des choses.
    Pour les personnes qui n'ont pas l'habitude de cela, que ce ne soit pas un frein. Cette nouvelle rubrique est l'occasion pour vous, de voir comment réfléchissent les scientifiques, quels sont leurs idées, leurs limites. N'hésitez donc pas à participer et à poser des questions.

    Pour la modération,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Bonjour,

    Superbe discussion. Sans transition, je trouve que le résultat en agar mou avec les HEK transfectées avec H-Ras n'a rien de contradictoire avec le fait que H-Ras ne soit pas nécessaire pour l'immortalisation des cellules. D'une part, l'expérience en agar mou permet avant tout de voir si les cellules sont capables de proliférer malgré l'absence d'adhérence. L'immortalisation est nécessaire puisque souvent cette expérience s'étale sur 3 semaines environ mais ce n'est pas le critère mis en avant par cette méthode. D'autres part, les cellules HEK sont d'origine embryonnaire, elles appartiennent donc à des stades de différenciation peu avancés. De ce fait on a expression de la télomérase, une expression intermédiaire entre une cellule souche et une cellule différenciée, globalement. Ceci explique donc (cela ne regarde que moi ) que seules les HEK arrivent à former des colonies, à la différence des fibroblastes qui en sont incapables (puique étant des cellules différenciées) . A noter tout de même que les HEK ne forment pas de glorieuses colonies comparées à leurs consoeurs transfectées H-Ras/hTERT.

    Pour la question sur la télomérase et son importance dans la formation de tumeurs. Les chiffres parlent par eux-mêmes : dans 80 à 90% des cancers on observe une expression inappropriée de la télomérase...Reste encore 10% des cancers qui ne l'expriment pas. Donc elle n'est pas indispensable mais reste un facteur très avantageux pour une cellule tumorale l'exprimant. D'ailleurs Vinc a parlé d'un article ayant montré que la télomérase n'est pas indispensable à la formation de tumeurs :

    il a été montré en 2004 dans un journal plus modeste que la télomérase n'est pas nescessaire à l'obtention de cellules tumorales humaines et que seuls Ras et AgT suffisent (dans des cellules adrénocorticales humaines) même si les cellules rentrent rapidement en crise (et donc la tumeur ne grossit pas beaucoup)
    L'immortalisation étant nécessaire à l'apparition de tumeurs, on peut prendre peut-être un raccourci (...) en disant que l'immortalisation peut se passer de la télomérase mais là je parcours un terrain trop inconnu...

    Greg

    PS : les raccourcis en bio donnent souvent lieu à des ramassages en beauté
    Dernière modification par LXR ; 06/02/2009 à 19h48.
    Never give up.

  13. #10
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut.
    Je ne suis pas certain de la pertinence de ta remarque quant à l'origine embryonnaire des HEK (human embryonic kidney). Comme leur nom l'indique, elles dérivent de rein embryonnaire. Rien que cela indique qu'elle n'est pas si indifferenciée que cela. En fait, le développement embryonnaire n'est pas une étape de tous les possibles. Les cellules se différencient déjà largement. La nature de ces cellules reste très indécise. Fibroblaste? cellule épithéliale? endothéliale? Voir même des neurones...
    Dire c'est embryonnaire, donc c'est peu différencié est un raccourci et...
    ...les raccourcis en bio donnent souvent lieu à des ramassages en beauté

    Pour la télomérase, je pense qu'il ne faut peut être pas voir le mécanisme mais la finalité. Toute division entraine mécaniquement un raccourcissement des télomères. Il n'y a rien à faire, c'est nécessaire. Dés lors, une cellule immortelle qui n'exprime pas la télomérase a nécessairement trouvé un autre moyen de réparer ses chromosomes ou alors de survivre sans télomère (avec l'ADN circularisé). Donc oui, l'immortalisation pourrait se passer de la télomérase, mais pas d'un moyen de contourner la difficulté.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  14. #11
    gorben

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut,

    Je ne suis pas un habitue de la technique, mais a utiliser des retrovirus ils ne risquaient pas de "toucher" a autre chose? Des plasmides n'auraient pas ete plus adaptes?

    A+

  15. #12
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Pour répondre à Piwi. En effet, ma réponse à ce sujet était assez abrupte. Je continue de défendre ma cause car pour moi ce n'est pas un hasard si les HEK arrivent à former des colonies avec H-Ras seul (+ Ag T) à la différence des fibroblastes. J'apporte une nuance : au sein d'un tissu embryonnaire, la probabilité de trouver des progéniteurs (je ne parle pas de cellules souches) est plus importante que dans le même tissu adulte, on est d'accord? Une lignée cellulaire étant plus ou moins hétérogène, dans la lignée HEK on a donc beaucoup de chance d'avoir affaire à un nombre non négligeable de progéniteurs rénaux au sein de la population cellulaire. Ce sont probablement ces mêmes progéniteurs qui donnent quelques colonies en agar mou, ils sont sélectionnés (involontairement) par la méthode utilisé qui nécessite un potentiel replicatif illimité, pour ne pas parler d'immortalisation. Mes dires ne sont que des hypothèses mais ça ne me semble pas si infondé que ça.

    Greg
    Never give up.

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  17. #13
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Petite correction (à moins que je me trompe encore ) mais ce n'est pas Bob mais Robert A. Weinberg...(Bob Weinberg existe mais c'est pas le bon vieux Robert).

    Greg
    Never give up.

  18. #14
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Une lignée cellulaire étant plus ou moins hétérogène, dans la lignée HEK on a donc beaucoup de chance d'avoir affaire à un nombre non négligeable de progéniteurs rénaux au sein de la population cellulaire.
    Non, une lignée cellulaire est supposée être uniforme. Au moins au début. C'est au fil des repiquages dans tous les labos où elle passe qu'elle dérive. Par exemple, je bosse avec une lignée de spermatogonie. Heureusement qu'au milieu il n'y a pas de fibroblaste, de cellule de Sertoli ou de cellule myoepithéliale. Sinon je ne verrais pas bien l'intérêt.

    Sinon la question, à laquelle je n'ai pas spécialement la réponse, c'est à quel stade du développement fœtal a été crée la lignée. Les progéniteurs rénaux pour moi ce sont les cellules des nephrotomes et encore avant les cellules du mésoderme intermédiaire. Une fois un rein en place (y compris les reins embryonnaires), Les cellules ont une fonction et on peut différentier un fibroblaste d'une cellule épithéliale d'un tube rénal ou d'un neurone.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  19. #15
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    OK. J'ai toujours travaillé avec des lignées cellulaires cancéreuses où on parle toujours d'hétérogénéité, mais ceci est inhérent au phénotype cancéreux. Donc on ne peut rien apporter de plus que ce que les auteurs disent, à savoir que l'apparition de colonies malgré l'absence d'immortalisation chez ces cellules provient peut-être de l'antigène T.

    Greg
    Never give up.

  20. #16
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Je reviens sur la technique de transformation par retrovirus.

    Le point soulevé n'est pas inintéressant parce qu'il me semble exact. L'utilisation de retrovirus permet de faire une transformation intégrative simplement et rapidement. Cependant le défaut de la cuirasse c'est que vous ne savez pas où s'intègre les inserts.
    Je ne sais pas comment ils ont procédé exactement. La technique que je connais consiste à utiliser une lignée de cellule particulière pour produire des virions, lesquels servirons à infecter la lignée d'intérêt. Le problème c'est que du coup votre lignée d'intérêt est hétérogène au niveau des insertions. Il devrait théoriquement possible être de sous cloner et d'analyser un clone que l'on utilisera. Pas certain que ce soit fait.
    Dés lors en l'absence de sélection il serait sans doute possible de contre sélectionner des artéfacts avec la technique que je décris. Il faudrait que l'on sache comment ils ont procédé.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  21. #17
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    A leur époque ce n'était pas possible car des banques de séquences du génome humain complètes n'existaient pas, mais actuellement le mieux serait de séquencer un côté de l'insertion en faisant une marche sur le chromosome et cribler les banques de séquences avec la séquence d'un des deux côtés flanquant l'insert. Ainsi on peut savoir systématiquement le site d'insertion utilisé par le rétrovirus.

    Greg
    Never give up.

  22. #18
    gorben

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    A leur époque ce n'était pas possible car des banques de séquences du génome humain complètes n'existaient pas, mais actuellement le mieux serait de séquencer un côté de l'insertion en faisant une marche sur le chromosome et cribler les banques de séquences avec la séquence d'un des deux côtés flanquant l'insert. Ainsi on peut savoir systématiquement le site d'insertion utilisé par le rétrovirus.

    Greg
    Je trouve qu'il manque non seulement le site d'intregation du retrovirus (meme sans la sequence, y'a des moyens de connaitre le site d'integration), mais egalement le controle avec le retrovirus seul integre au meme endroit du genome.
    J'imagine que l'article voulait mettre en evidence la composante genetique du cancer et pas le role specifique de TERT et ras, m'enfin je trouve que les controles sont quand meme leger, surtout pour un Nature.

    A+

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  24. #19
    Yoyo

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut

    tu pourrais préciser ce qu'apporterai ses informations ? je ne suis pas certain que ca soit évident pour tout le monde.

    merci
    YOyo

  25. #20
    LXR

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Je suis du même avis que Gorben, j'expose donc ce que je pense à propos de la nécessité de ces contrôles. Ce qui ne dispense pas Gorben de venir me contredire ou me compléter.

    La connaissance du site d'intégration est nécessaire car dans le cas où l'insertion se fait dans un gène suppresseurs de tumeurs par exemple, on a tout à fait le droit de penser que la transformation tumorale ou l'immortalisation peuvent lui être liées par le biais de l'invalidation d'un processus de contrôle. Dans le cas où l'insertion se fait de façon à générer une protéine de fusion, là encore on peut penser que Ras ou hTERT seul ne sont pas suffisant et que c'est la protéine de fusion X-Ras et/ou X-hTERT qui en est responsable, on a encore une incertitude.

    Le contrôle avec le rétrovirus seul aurait permis de contrôler que le processus de transduction rétrovirale n'est pas lui-même responsable de la transformation et/ou de l'immortalisation des cellules saines.

    Donc en effet ces contrôles me semble être d'une importance capitale. Mais ce ne sera pas la première fois ni la dernière qu'on verra un Nature ou autre revue à fort impact, manquer de rigueur sur certaines expériences....surtout lorsque ce sont des chercheurs influents.

    Greg
    Dernière modification par LXR ; 10/02/2009 à 09h47.
    Never give up.

  26. #21
    Yoyo

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut

    c'est clair que ces controles semblent importants, mais quel quantité de travail représentent-ils ? par rapport au reste du travail publié?
    Sinon est-on certain qu'il n'y aura qu'un seul site d'intégration? car s'il y en a plusieurs ca va sérieusement compliqué l'analyse et les interpretations.

    YOyo

  27. #22
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    A priori si on séléctionne uniquement l'intégration et que l'on construit la lignée sur les cellules séléctionnées il y aura plusieurs sites d'intégration. La lignée est hétérogène. Si l'on fait une transformation controle avec un plasmide vide ou contenant un élément neutre, on devrait pouvoir discriminer les effets inserts dépendants des effets vecteur dépendants.

    Maintenant, séléctionner les clones recombinants peut être facile. J'avais déjà évoqué une methode que j'utilise pour y parvenir:

    __HA-insert_IRES_IL2R__

    Vos cellules co-expriment votre insert et le récepteur membranaire de l'interleukine 2. Du coup vous pouvez faire un tri avec des billes contenant un IgantiIL2R ou facilement par FACS.
    Si vous ne faites pas cela... C'est tout de suite plus rock. A mon avis il faut au moins conserver le Tag avec l'insert faute de quoi on est dépendant de l'insert, de la disponibilité d'un anticorps etc... Le merdier.

    Une fois que vous avez fait cela il faut encore localiser les sites d'insertion. C'est du boulot à mon avis mais tout dépend encore de la précision recherchée. Si vous n'êtes pas trop regardant sur le locus peut être qu'une "simple" hybridation in situ ADN/ADN peut suffir. Sinon, faut aller plus loin... Violent.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  28. #23
    Yoyo

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut

    donc d'apres ce que tu décris c'est quand meme un sacré boulot pour vérifier le site d'integration! comme control c'est donc loin d'etre trivial, pour un résultat qui n'est peut etre pas vraiment essentiel non?

    De plus le papier a 10ans que le papier est publié (ce qui implique que les manips ont été faites il y a 11 ou 12 ans au mieux), les techniques n'étaient surement pas aussi au point que maintenant et les vérifications bien plus compliquées non?

    Ceci explique peut etre que ces controles n'aient pas été fait.

    YOyo

  29. #24
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    C'est assez exactement ce que je voulais suggérer.
    Faudrais que je vois le papier en détail (je comptais un peu sur vinc pour répondre) mais si ils ont une culture contrôle transformée à vide ou avec un transgène non relevant, je pense que ça fait parfaitement l'affaire pour vérifier un effet d'insertion. Sans avoir lu le papier je suis à peu près certain qu'il doit y avoir un bidule dans le genre.

    EDIT:
    Je viens de survoler le papier et comme tous les nature ou science la réponse est presque subliminale. Elle tient sur une ligne:
    "For each infection, parallel cultures were infected with control retroviruses specifying only a drug resistance gene as controls."
    Conclusion, le boulot est fait.
    Dernière modification par piwi ; 13/02/2009 à 12h00.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  30. Publicité
  31. #25
    gorben

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut,

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Je viens de survoler le papier et comme tous les nature ou science la réponse est presque subliminale. Elle tient sur une ligne:
    "For each infection, parallel cultures were infected with control retroviruses specifying only a drug resistance gene as controls."
    Conclusion, le boulot est fait.
    La je ne suis pas d'accord, ils ont bien un controle, mais aucun moyen de verifier que le site d'integration est le meme que dans leurs essais. Si l'integration se fait au hasard, ca peut faire une difference.

    Dans la mesure ou ils ont des microcolonies sur agar mou, ne peuvent ils pas partir du postulat 1 cellule donne 1 colonie homogene (comme pour les bacteries)? Dans ce cas recuperer la colonie et screener pour le site d'integration devrait etre plus simple non? Pour mettre en evidence des sites d'integration d'ilot genomique, j'utilisais classiquement une PCR avec un primer specifique et un primer degenere puis sequence. Puis une PCR nichee sur mes premiers produits. Ca donne d'assez bon resultats, au moins chez les procaryotes.

    A+

  32. #26
    piwi

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Le problème c'est que la transformation rétrovirale ne donne pas une insertion à un site unique dans toutes les cellules. Donc il me semble qu'il faut voir les choses de manière statistique. Dés lors qu'il y a un contrôle de transformation, une différence observée peut être liée à la présence du transgène.
    Ensuite, et je ne suis pas microbiologiste, il me semble que le génome d'une bactérie est plus simplement organisé et moins morcellé qu'un génome humain. Il y a 10 ans, le génome n'était pas séquencé. Il ne suffisait pas de faire une PCR et aller sur NCBI pour trouver le locus d'insertion.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  33. #27
    Yoyo

    Re : Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

    Salut

    la derniere remarque de Piwi mets le doigt sur un point important il me semble. Faire attention de "jauger" un article en fonction des connaissances et des techniques de l'époque (meme en 10ans ca evolue vite!).

    Yoyo

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