mesure de l'expression d'un gene

[constance]

bonjour
je viens de finir mon DEA et à montpellier, pour bien nous achever apres l'année de DEA , nous devons passer un concours en septembre en presentant un projet virtuel pour obtenir les bourses de these... Virtuel = on n'est pas du domaine. Alors j'ai une petite question, comment puis je mesurer le taux d'expression d'un seul gène?
merci de m'éclairer un petit peu
sinon ce forum est tres sympa
constance

[ciss_ou]

Salut!

Je pense que pour mesurer l'expression d'un gène, une technique assez simple à mettre en oeuvre est le northern blot, tout simplement.
Sinon, tu peux toujours extraire les ARN totaux et faire des cDNA que tu analyses par PCR quantitative, semi-quantitative, ou même puce à ADN si tu as les moyens . Mais si c pour un seul gène, ça ne parait pas très adapté...

Voilà tout ce qui me vient à l'esprit pour l'instant, il faudrait surement un peu plus de précisions pour une réponse plus complète.

[Yoyo]

Bonsoir

Si on cherche a déterminer le niveau d'expression d'un gene, cela reviens aussi a determiner l'activite du promoteur.
Il est donc possible de remplacer le gene en question par un gene rapporteur (dont l'activité de la proteine est facilement quantifiable B-galactosidase, luciferase etc...)

Il ne reste plus qu'a quantifier l'activite de l'enzyme par rapport a un control.

Yoyo

[Mari]

Salut,
J'suis une amie de Constance et je fais aussi cette histoire de projet virtuel cet été (bonnes vacances )
C'est super ce forum parce que c'est un peu dur de trouver encore des gens qui bossent dans nos labos en ce moment (on est mal, on est mal)!!!!! Donc j'aurais bientot plein de questions moi aussi, et je voulais juste dire aux gens qui proposent des solutions (merci, merci) que le principe de cet épreuve est d'imaginer un projet et des manips, donc lachez-vous, on s'en fout du coût, on fera pas les manips!!!!!!!!Merci!!!!!

[John78]

Yoyo,

Est-ce imaginable un gène pas trop exprimé au niveau de la transcription mais avec un messager très stable et qui as une durée de vie très importante ce qui induirait donc une forte expression ? Ou est-ce que globalement tout les ARNm ont une durée de vie proche et donc le taux d'expression est surtout rapport aux taux de transcription ?

Merci
John

[Yoyo]

Bonsoir,

John, ta remarque est tres pertinente. En effet la stabilite de l'ARNm est un parametre interessante. Mais generalement quand on parle de taux d'expression, c'est que l'on parle du taux de transcription. La question "physiologiquement" plus interessante serait de se demander le taux d'expression d'une proteine. Dans ces conditions, la stabilite de l'ARNm entrerai en compte.

Sinon, pour repondre a ta question, a ma connaissance il n'y a pas d'ARNm suffisamment stable pour compenser un faible taux d'expression. En plus il semnle que les genes faiblement expimes possedent aussi un biais d'utilisation des codons particulier, indiquant aussi que la traduction n'est pas optimale pour ces genes.

C'est le cas general, maintenant il existe certainement un contre example

Yoyo

[John78]

Salut

Merci pour la réponse, on pourrait peut etre faire dans ce cas des dosages d'expression de la protéine par Western ou par tout autre méthode utilisant des anticorps ???

A+
John

[constance]

en fait il faut mesurer le taux de transcription par Run-ON qui mesure que la transcription et non pas par northern qui mesure la quantité globale d'ARNm à l'équilibre.
De même pour la traduction il vaut mieux utiliser le marquage métabolique que le western.
Voilà les résultats de mes investigations scientifiques

sinon pour la question de john, il m'a donné une idée, si la transcription de mon gène ne varie pas et que la traduction varie, c'est peu etre pas a cause de la traduction elle même mais à cause de la stabilité de mon ARNm. Merci john!

Constance

[Igothigh]

en fait il faut mesurer le taux de transcription par Run-ON qui mesure que la transcription et non pas par northern qui mesure la quantité globale d'ARNm à l'équilibre.
De même pour la traduction il vaut mieux utiliser le marquage métabolique que le western.

Tout dépend de la question que tu te poses. Pour le Run-On, on sort quand même du contexte physiologique. Et j'ai comme dans l'idée (peut-être fausse) que quantifier l'expression d'un gène par run-on n'est pas fiable (voire pas recommandé). Pour ma part, la PCR quantitative me parait être un bon outil pour déterminer le niveau d'expression d'un gène à un temps t.
Pour les techniques de marquage métabolique ou de western, les questions ne sont pas du tout les mêmes. L'un permet d'estimer la quantité de protéine synthétisée (attention aux protéines instables et rapidement dégradée), l'autre c'est la quantité de protéines présente à un temps donné (néosynthèse ou pas, dégradation ou pas).

[constance]

En fait, je crois que la PCR quantitative est plus fine pour quantifier, mais comme le northern, cette technique va m'indiquer la quantité de proteine présente à un temps t, or je veux connaitre le taux de transcription d'un ARN et pas sa concentration.
Pour la proteine, le western en effet ne prend pas en compte le fait que la proteine peut se dégrader rapidement, encore une fois la question que je me pose est " quel est le taux de traduction de mon ARN dans telles conditions, je pense donc que le marquage métabolique pendant un tps t est plus précis car il évite le biais de la dégradation de ma proteine.
je peux lourdement me tromper alors si vous etes pas d'accord dites le moi!

[Yoyo]

salut,

Moi j'ai surtout l'impression que tu confonds traduction et transcription tout au long de ton message...
La PCR et le northern ne te donneront pas le taux de protéine globale, mais le taux d'ARNm!
d'ailleurs la PCR quantitative est plus fine que le run-ON et je suis d'accord avec les objections d'Igothigh, n'etant pas dans des conditions physiologiques le taux obtenus n'aura aucun sens biologique. D'ailleurs si tu utilises le promoteur natif du gene comment compte tu faire ton run-on sans purifier la polymerase et les proteines accessoires necessaires?

Si tu utilises un systeme rapporteur comme je le suggerait dans mon premier message, tu n'as plus les problemes de stabilite qui intervienne, puisque c'ets un parametre commun avec tes témoins.

POur ton marquage metabolique, tu ne fais pas abstraction totalement de la stabilite de la proteine tu n'arriveras pas a marquer une proteine tres instable...sauf si alors tu inactives le proteasome
la premiere chose sera donc de determiner par puls-chase si ta proteine est stable et qu'elle est sa demie-vie. Ensuite, tu pourras raisoner sur tes marquages.

Yoyo

[constance]

gloups en effet j'ai tapé un peu vite, pour Run ON et PCR quantitative c'est pour l'ARNm et pas la proteine sorry mais ce que je voulai dire c'est que oui la PCR est plus fine mais c'est une mesure de la quantité globale d'ARN aussi fine soit elle. Le RunON dose l'ARN transcrit pendant un temps t, et comme je veux connaitre mon taux de transcription, c'est plus adapté non?
Je ne peux pas utiliser de système rapporteur, car je veux étudier un couple d'ARN sens et antisens dont les sequences se chevauchent. Ce n'est pas la force des promoteurs qui m'intéresse, mais la transcription de l'un par rappport a l'autre, et peut etre l'effet de l'anti-sens sur le sens.
Enfin pour le marquage métabolique, je ne supprime pas le biais de la stabilité de la proteine c'est vrai, mais je ne mesure plus que les proteine traduites pendant un temps donné et non pas la quantité totale dans la cellule. Si j'inactive le protéasome je peux optimiser ma mesure? c'est cool ça...
désolé pour mon message d'avant plein de fautes d'innattention.

[9herve]

pour la taux de transcription c'est bien le Run-on.
pour la quantité d'ARNm , Northern -blot ou slot-blot, Real time PCR (Si l'on dispose de peu de matériel car c'est onéreux par rapport au northern!).Dans tous les cas il faut faire des statistiques et il y a toujours le problême de standard interne (qui permet de pondérer les valeurs). En théorie on utilise un gène dont l'expresssion est supposée constante selon les tissus ou les stades de développement (GAPDH, actine, RP49 etc) mais, en pratique il est clair qu'il n'existe pas de gènes "constants".

[Steph]

Salut,

Je confirme que pour analyser rapidement la taux d'expression d'une protéine particulière, on utilise le western blot (WB). C'est une technique facile à mettre en oeuvre, éprouvée, qui permet de faire des comparaisons très rapidement (plusieurs échantillons en même temps) et relativement rapide. Le seul inconvénient, mais qui est déterminant: il faut posséder une anticorps fiable dirigé contre la protéine d'intérêt!!
Pour les génes, je ne suis pas spécialiste, mais il y a maintenant les fameux "chips", qui permettent d'analyser des milliers de gènes/produits d'expression d'un coups. Et comme tu dis que le prix n'est pas un problème...

Stéphane, ex-chercheur

[Sillage]

Tu peux aussi faire une RT-PCR, cela t'indiqueras si il y a bcp d'ARN à un instant t et un milieu t.