Problème de WB, HRP sensible à la lumière ?

[invite4944608c]

Bonjour tout le monde,

En ce moment j'ai un problème avec mes western blot.
Je sais que dans certains labo le blot de l'anticorps secondaire se fait à l'abri de la lumière. Je n'ai pas l'habitude de faire comme ça et jusqu'à présent je n'avais pas de problème.
Mon chef m'a dit que la HRP couplée au secondaire était sensible à la lumière. Après quelques recherches je n'ai pas trouvé de document qui allaient dans ce sens (en plus, les tubes dans lesquels je reçois mes secondaires ne sont pas opaques !)
Le luminol et l'H2O2 étant sensibles à la lumière, je fais attention à protéger mes solutions de révélation.

Est ce que quelqu'un serait en mesure de confirmer ou d'infirmer les dires de mon boss s'il vous plait ?!
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[Effie]

Je n'ai jamais entendu que l'AC secondaire couplé à la HRP était sensible à la lumière, et quand je faisais des western blot je ne réalisais que l'étape de révélation à l'obscurité.

Quels problèmes rencontres-tu avec tes western? Est-ce une mise au point ou une technique qui a déjà fonctionné et qui d'un seul coup se met à donner des "choses bizarres"?

[Jean-Luc P]

Je confirme els dires d'Effie, la HRP n'est pas particulièrement sensible à la lumière.

[invite05b13c7f]

Non, la HRP n'est pas sensible à la lumière. Il y a seulement la révélation qui doit se faire à l'obscurité!
Je fais beaucoup de western blot avec la HRP, et on laisse l'anticorps 1h à la lumière.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4944608c]

Merci pour vos réponses. C'est bien ce que je pensais, c'est seulement les solutions de révélation qui doivent être protégée de la lumière.

Effie,
Parfois, mes membranes sont toutes grises quand je les révèle, mais pas à tous les coups. C'est la cas avec des WB qui ont déjà fonctionné avant.

Avant je réalisais les différentes étapes dans des boîtes et maintenant je le fais en tube (falcon 50). C'est plus propre mais est ce que les tubes pourraient être la raison du "grisâtre" de mes membranes ?

[Effie]

Quand le western blot se met à "déconner", il faut remettre en question tout le matériel et toutes les solutions utilisées.... c'est une enquète minutieuse qui pourra te permettre de résoudre le problème.

Commence par réutiliser des boîtes, ça te permettra de savoir si les problèmes sont dus aux tubes falcon, et remets en question tout ce qui a pu changer dans ta technique depuis que les westerns ne fonctionnent plus bien:
- vérifie tous tes produits (fabrication des gels, des différentes solutions genre celles que tu utilises pour diluer tes anticorps). Si tu as le moindre doute sur un produit (date de péremption, conservation à la mauvaise température, cpontamination, ...): utilise un produit neuf. Vérifie que tu n'as pas changé de fournisseur pour un des produits, ou de marque de lait en poudre si tu en utilises. Refais toutes tes "sauces".
- demande-toi si les problèmes n'ont pas commencé au moment où tu as commencé un nouveau tube d'anticorps (si plusieurs types de western blot posent problème, utilisent-ils tous le même AC secondaire?). Si tu as changé de tube d'anticorps, s'agit-il du même lot et de la même date de fabrication que l'ancien?
- vérifie aussi tes produits de révélation.

Cette "enquète" peut être longue et fastidieuse, mais c'est la seule solution pour isoler le fautif dans la technique....
Bon courage, donne-nous des nouvelles!