Dosage sur gel

[adeline87]

Bonjour,

Je dois déterminer la concentration des différentes bandes d'électrophorèse issues d'une PCR (bandes des puits D1, D2, D3). Pour cela, j'utilise les concentrations connues du lader (lambda/HindIII).

Je dois comparer la largeur et l'intensité des bandes entourées en bleu avec celles du lader (Lambda) les plus proches mais j'ai du mal car l'intensité est très différente (celle du lader est faible par raport à celle des PCR). Est-ce que je peux les comparer avec celle encadrée en rouge ?

Pouvez-vous m'aider ?
Merci

[jmbowie]

Hélas, il y a un écart de taille conséquent (je suppose, de mes souvenirs de ce marqueurs) entre les bandes entourées et celles qui iraient le mieux. Si tu veux utiliser quand à tout prix les bandes "rouges" du ladder, tiens compte de la différence de taille (il suffit de pondérer par le rapport des deux tailles).

Ceci dit, je conseille de doser avec des intensités ni trop faibles, ni trop fortes: ici, la quantité de ton produit de PCR est si importante que le gel sature. J'aurai conseillé à un stagiaire d'exposer un peu moins fort pour vérifier que D3 n'est pas une double bande. Et cela permettra d'avoir une photo avec les bandes "rouges" qui ne saturent pas, augmentant ainsi la précision de ton dosage.

Enfin, je ne sais pas pour quoi tu veux utiliser tes produits, mais en général on dose les produits de PCR sur gel avant une réaction enzymatique (PCR, digestion, ligation, déphosphorylation, tailing, etc.). Et dans tes tubes, il n'y a pas qu'un seul amplifiat (au moins 5 ou 6 en D3, minimum 2 dans les autres....sauf si il s'agit de restes d'amorces). C'est pourquoi je te conseille de les purifier sur gel (Kit par exemple) avant de les doser, sans quoi la réaction enzymatique qui suit se fera sur l'ensemble de tes produits...

[adeline87]

Merci de ta réponse.

En fait je devrais obtenir théoriquement que les 2 fragments entourés correspondant au gène que je voulais amplifier. les autres fragments sont aspécifiques et je ne dois pas m'en préoccuper pour le dosage.

Le problème c'est que je dois absolument faire une estimation sur gel de la concentration des produits de PCR mais j'ai beaucoup de mal du fait de la grande différence d'intensité.

Est-ce que je peux dire pour D2 : la largeur est 3 fois plus importante que le fragment de 2030 pb (au niveau de la flèche) donc la concentration est triplée. L'intensité est aussi plus importante donc la concentration est plus que triplée.
Je ne peux pas être plus précise ?

[jmbowie]

Je te conseille de purifier ton produit sur gel. Même s'il y a beaucoup de produit, je pense pas que tu satures les colonnes des kits (au cas ou, ne fais migrer que 75% de ton volume qui te reste).
Pendant la purification, tu vas perdre du produit (fatalement) donc il te faudra le redoser à ce moment là.

[adeline87]

En fait c'est un TP que j'ai fait et je ne peux plus rien changer. Je dois analyser mes résultats.

[jmbowie]

En fait c'est un TP que j'ai fait et je ne peux plus rien changer. Je dois analyser mes résultats.

D'accord, alors fais avec les bandes les plus proches (c'est ce qu'attend ton prof). Nuance ta réponse en disant que l'on ne peut exclure la présence de 2 bandes en D3.

[Yoyo]

ET surtout nuance en disant que l'intensite des deux bandes est saturante en consequence de quoi ton resultat n'est qu'approximatif. Explique ce que tu aurais du faire (moins exposer).

YOyo

[adeline87]

Y a t'il un ordre de grandeur pour les concentrations des fragments de PCR ?