Bonjour,
j'aimerais savoir pourquoi les agrégats de proteines absorbe à 320nm et non plus à 280nm ? je sais bien que l'absorbance est due en particulier au acides aminées aromatiques comme le tryptophane mais que se passe t-il ? les cycles aromatiques sont demasqués lorsque la protéine s'agrége du coup on monte à 320nm???
J'aimerais bien comprendre
Merci beaucoup pour vos éventuels réponses
Bonjour,
Je me permet de citer ce court extrait trouvé sur le site de l'université de montpellier-2.
La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux résidus tryptophane et tyrosine. La grand majorité des études est faite avec les tryptophanes, puisque la tyrosine a un rendement quantique de fluorescence plus faible, et souvent elle transfert son énergie aux tryptophanes. Les tryptophanes sont excités à 280 nm. Si on veut éviter l’excitation des tyrosines, on excite à 295 nm (longueur d’onde à laquelle les tyrosines n’absorbent presque plus). Le spectre d’émission des tryptophanes va de 300 à 400 nm. La longueur d’onde à laquelle on a un maximum de fluorescence dépend de la polarité de l’environnement des tryptophanes : Pour un environnement apolaire (par exemple au cœur hydrophobe d’une protéine), lmax = 330 nm ; pour un environnement polaire (par exemple dans l’eau), lmax = 350 nm.
Bref, selon que tes protéines soient "libres" ou agrégées, la polarité de l'environnement des Trp doit être différentes, ce qui explique que tu devrais observer une variation de la fluorescence, et à 320nm, cela doit être le plus visible.
Merci pour ta réponse.
Autre petite question:
l'agrégation d'une proteine est reversible?
Bonsoir,
je n'ai pas de réponse "tout ou rien" à te fournir à ce sujet. Je pense que celà doit beaucoup dépendre de quel type d'amas de protéine.
Cependant, la formation d'agrégat de protéines est un trait commun à de nombreuses maladies neurodégénératives (Parkinson, ESB, syndrome de l'X fragile, etc...).
Ici, ces agrégats sont irréversibles et semblent être responsable de la mort cellulaire.
Je ne suis pas un spécialiste, donc, je ne me prononcerais pas d'avantage.
En tout cas, il apparait assez clairement que, in vivo, tous les agrégats ne peuvent pas être dé-aggrégés.
Generalement, les aggrégats se forment suite à des défauts de repliement de protéines qui, au lieu d'"enfouir" leurs résidus hydrophobes, les exhibent à leur surface, créant l'aggrégation par interactions hydrophobes. Autant que je sache, ces agrégats sont, généralement, détruit par la cellule qui les stock dans des agrésomes.
Je ne sais pas le devenir de ces agrésomes, j'imagine qu'ils sont soit excrétés soit détruits par le lysosome ou le protéasome.
Bref, je serais donc plutot tenté de dire que la cellule se débarasse de ses aggrégats de protéines mal repliées, plutot que de tenter de les re-déplier.
Peut etre existe il des "chaperons" capable de redéplier une protéines mal dépliée... mais, je n'en ai jamais entendu parlé.
Mais bon, encore une fois, je ne suis qu'un modeste étudiant.
Si quelqu'un en sait plus....
Morphine
bonsoir!
la réponses UPR (unfolded protein response) Est constituée de multiples actions dont le but est de "remettre dans le circuit" des protéines à la mauvaise conformation.
Ces processus se passe à la base dans le RE.
voici un beau petit texte que j'ai trouvé, mais pas entièrement lu malheureusement...(demain cela sera fait)
http://ist.inserm.fr/basismedsci/200...85_Barouki.pdf
Vu que je n'ai pas tout lu, je ne sais s'il traite des agrégats, mais je sais qu'il le fait pour des protéines isolées à la mauvaise conformation, qui formeront peut etre des agrégats...
amicalement,
greg
La science consiste à passer d'un étonnement à un autre. (Aristote)
Salut Bacillus.
Ta question et les réponses qui suivent me laissent perplexes.
A ma connaissance un aggréagat de protéine (présentant des AA aromatiques) absorbe toujours à 280nm. En revanche, en cas d'aggrégation l'ensemble de ta préparation protéique commence à devenir trouble, favorisant un effet de diffusion de lumière lors de la mesure UV-visible. Du coup, ce n'est pas spécifiquement la longueur d'onde à 320nm qui augmente mais la ligne de base de ta mesure. Je ne pense pas que la fluorescence intervienne là dedans.
Concernant la reversibilité de l'aggrégation, tout dépend des conditions d'expression, d'observation et de la bonne volonté de la protéine.
Pour faire dans la provocation, tout aggrégat protéique non covalent in vitro est à priori réversible : par exemple en 6M Cl guanidine + 1% SDS à 100°C je ne connais pas d'aggrégats qui résistent, mais la protéine est dénaturée... Cependant, j'imagine que ta question suppose que tu souhaites garder ta protéine dans un état natif. Certaines protéines ont la faculté de se renaturer, mais l'optimisation des conditions de renaturation peut être fastidieux.
Note cependant, que certains aggrégats se dissolvent simplement en changeant les conditions saline, de pH, ou en ajoutant des détergents 'doux'....
In vivo, je maîtrise moins.
Je sais que certains aggrégats cristallin de protéine ont été observés. Dans ce cas, on les considère à ma connaissance réversible, puisqu'ils servent soit au stockage soit à optimiser l'entassement d'un maximum de protéine dans un minimum de place (exemple de la membrane pourpre).
Je dirais pour finir qu'en théorie tout aggrégat protéique non covalent est réversible. Il suffit thermodynamiquement de franchir la barrière énergétique qui a mené au processus d'aggrégation et inverser l'équilibre d'aggrégation:
( protéine -> aggrégat ), par exemple en mettant en place un mode de repliement assisté (chaperonne) ou un mode de dégradation de la protéine.
J'espère avoir répondu assez clairement à tes questions.
Merci Cytochrome tu répond trés bien à ma question.
Enfête je fais de la production dans le cytoplasme d'E.Coli sous forme insoluble, je resolubilise avec 8M urée j'essaye ensuite aprés purif de renaturer par des détergents... en même temps j'élimine l'urée et la la j'observe des agrégats mais au cours du temps progressivement pendant la renaturation les agrégats on disparus!! c'est donc pour sa que je posé la question
Je pense que ma protéine s'est renaturée.J'attend de la caractériser!!
Merci beaucoup pour vos réponses à tous
Tant mieux si tes aggrégats ont disparu, c'est le but de la renaturation.
Pour la caractérisation je conseille:
1) un test d'activité (fixation ligand, activité enzymatique, fluorescence...)
2) un test de solubilité et oligomérie (gel filtration et si pur: DLS, UCA, EM)
3) si pas de test fonctionnel vérifier l'état de repliement par dichroisme circulaire ou RMN.
Bonne chance...
Tu travailles sur une protéine membranaire?
(Si ca continue on va pouvoir lancer le topic: "la protéine mystère"!)
Je travaille sur un fragments d'anticorps "scFv" (single chain fragment protein).
Ce fragments d'anticorps on le produit déjà dans le periplasme mais on obtient pas de super patate d'scFv fonctionnel. Du coup on essaye de le produire dans le cytoplasme ou la justement les patates apparaissent mais sous formes de corps d'inclusion! et donc le travail fastidieux consiste à renaturer les patates!!
Je caractérise par ELISA et des tests biacore.
Voila si t'as des données intéressante concernant la renaturation des corps d'inclusions pense à moi.
pardon scFv (single chain fragment variable)
