Séquençage non réalisable sur certains produits PCR
Bonjour,
J'ai un problème j'amplifie des produits de PCR de 1 à 7Kb pour ensuite réaliser un séquençage sur les produits obtenus.
J'utilise la LA Taq de Takara avec des conditions de PCR classiques mais le séquençage n'est pas possible. Les produits ont pourtant été purifiés deux fois.
Pourquoi le séquençage n'est pas possible.
Est-ce que quelqu'un aurait une bonne enzyme de PCR qui amplifie des produits de PCR de 1 à 7 Kb avec un très bon rendement ?
Je suis desespéré.
Bonjour,
L'enzyme en question ne devrait pas poser de problemes.
Quels controles as tu deja realises pour voir d'ou vient le probleme (ou d'ou il ne vient pas) ? par exemple, est-ce que le sequencage marche a partir de plasmides ?
Salut a toi,
perso j'ai jamais eu de pb avec la LA mm si je l'utilise pas énormément.
A tu suffisamment de produit de PCR? Es tu sur de tes températures d'hybridations ? Où se fait le séquençage?
Sinon ce serai qd mm mieux de faire séquencer ton fragment dans un plasmide...
bon courage en tout cas
Bonjour,
1ere question : comment fais-tu le séquençage ?
- toi-même ou quelqu'un d'autre ?
- dans ton labo ou une entreprise spécialisée ?
- quelle technique est utilisée : radioactivité ou fluorescence ?
2eme question : quand tu écris que le séquençage n'est pas possible, c'est parce que :
- on te l'a dit ?
- tu ne connais pas le début et la fin de ta séquence ?
- tu n'as aucun signal ?
- tu as un signal avec plusieurs séquences qui se superposent ?
Pour information, la réaction de séquence permet de lire 400 à 700 bases.
Pour lire une séquence de 7 kb, tu es obligé de faire plusieurs réactions de séquence de proche en proche ("marche sur le chromosomme") en choisissant des amorces tous les 500 pb environ.
Annaïck
Re : [biologir moléculaire] Séquençage non réalisable sur certains produits PCR
D'abord merci pour vos réponses.
En fait ce n'est pas moi qui réalise le séquençage de mes produits de PCR c'est un prestataire de service spécialisé dans le séquençage.
Moi je ne fait que des PCR à partir d'ADN extrait.
1. Les extractions sont correctes, j'obtient de bonne quantité en ADN
2. Ensuite lors des PCR j'ai dans un premier temps essayer avec l'enzyme "Ex taq" : j'obtenais des produits de PCR de très faible intensité (mais visible en augmentant l'exposition aux UV"
3. J'ai donc essayer avec la "La Taq" cette fois ci j'obtenais toujours les produits de PCR de même taille que précédement mais de plus forte intensité.
J'étais contente donc j'ai envoyer mes échantillons à séquencer.
Ce n'est même pas moi qui procède aux purifications, c'est le prestataire.
Mais pour certains produits de PCR ça pose problème, certains présentent des difficultés d'amorçage dans un sens de lecture (pas de signal ou peu) et une double séquence dans l'autre sens de lecture (soit après une centaine de bases soit au début de la lecture).
Parfois j'ai un signal qui se superpose dans ce cas là je vais repartir d'un seul clone.
Je ne vois pas d'où vient le problème.
Le mix de PCR de la La Taq est-il trop particulier ? (trop de Mgcl2)
C'est bizare.
Avez vous rencontré le même cas ?
Au fait ma température d'hybridation est de 59°C. (c'est spécifique)
Merci encore
Salut !
Les séquencages réalisés par les prestataires aujourd'hui sont en général réalisés avec une technologie qui aura du mal à amplifier d'un seul coup 1 kb ou plus. Il vaut mieux compter sur 500 pb environ. Le mieux à faire je pense est de téléphoner à ton prestataire, de manière à pouvoir discuter de détails techniques (quelle méthode ils utilisent, quelle sorte de Taq, combien de passages...). Tu pourras ainsi leur expliquer ton problème.
Cependant à ta place je me préparerais à faire un séquencage de proche en proche : regarde si il existe des homologues de la séquence que tu veux analyser, et dessine des amorces internes qui vont te permettre de séquencer ton fragment par petits morceaux : plus cher, mais plus efficace
En faite j’ai appelé hier pour savoir s’il avait des solutions à mon problème et savoir s’il avait déjà rencontré ce cas.
D’abord selon lui le mix de PCR et l’enzyme en question ne serait pas à l’origine de ce problème.
Mais il m’a conseillé de partir d’un clone pour tous les produits de PCR qui posent problème. En effet je part de suspension bactérienne d’une seule espèce et non d’un clone (pour lui c’est peut être ça le problème).
Je vais donc partir d’un clone en espérant que cette fois ci le séquençage pourra être effectuées.
Mais si ça pose toujours problème je vais faire comme tu l’explique, dessiner des amorces internes pour séquencer par petits morceaux. Mais j’espère que le fait de partir sur des clones va m’éviter ça.
Merci encore
Salut !
Hum... Effectivement il est arrivé le même genre de problème il n'y a pas longtemps dans mon labo, ou on a essayé de séquencer un fragment de PCR, qui s'est en fait révélé être 2 fragments de la même taille (donc on en voyait qu'un seul sur le gel). Ca ne marche pas très bien dans ce cas... Le passage par une étape de clonage supprime cette éventualité, car tu es sur de n'avoir qu'une seule copie par clone.
La quantité d'ADN est critique pour les réactions de séquences: essaye d'avoir au moins 600 ng de produits de PCR et de séquencer avec un amorce interne à ton produit (ca marche mieux comme cela).
Bonjour,
encore une question : quelles amorces utilises-tu pour faire ta PCR et quelles amorces sont utilisées pour faire la séquence ? Est-ce qu'il utilise tes amorces ou ils les définit lui-même ?
En effet, il arrive que les amorces s'hybrident à différents endroits de la matrice et amplifient plusieurs fragments (qui peuvent faire la même taille comme l'a dit Lord M). Cela arrive dans des régions riches en A/T ou avec des répétitions de motifs assez courts.
Pour moi, le problème vient a priori des amorces.
- soit elles sont contaminées (mélange avec d'autres ADN)
- soit elles sont aspécifiques et peu stingentes (toujours finir par 3 G ou C, pas de A ou de T en 3')
- soit il y a une erreur de séquence de la part du fabriquant
Annaïck.
Alors les amorces utilisées pour le séquençage sont les mêmes que ceux utilisées pour les PCR.
J'envoi les amorces en même termps que les produits de PCR.
De plus les amorces se finissent par un G ou C en extrémité 3'.
Il reste donc deux hypothèses :
- soit elles sont contaminées (je pense pas elles sont neuves)
- soit il y a une erreur de séquence de la part du fabriquant
Bonjour,
Envoyé par elobiotech
L'hypothèse la plus probable, surtout si tu as du mal à amplifier, c'est que tes amorces ne sont pas très bien choisies.
une erreur de la part du fabriquant ça arrive mais c'est rare : j'ai vu le cas 1 fois en 5 ans.
Le plus simple c'est de redefinir des amorces différentes qui seront plus efficaces. Un seul G ou C en 3' c'est peu pour une température d'hybridation de 59°C.
Comment fais-tu pour choisir tes amorces :
- à la main (2AT+4GC) ?
- avec des logiciels qui te permettent d'estimer la probabilité de formation de structures en "épingles à cheveux", la fréquence des sites d'hybridation aspécifiques, ou la formation de dimères ?
Annaïck.
Je cherche les oligos à la main. Mais là je vais voir si ça marche avec mes clones et si ça marche toujours pas je vais chercher d'autres oligos.
Merci
Au fait, juste une proposititon pour designer tes oligos : utilise Clone Manager. C'est un logiciel très couteux, mais ton labo peut l'avoir, il n'est pas très intuitif, mais tes amorces marchent très bien ensuite. C'est plus facile et beaucoup plus rapide qu'à la main.
Bonne soirée!
