Bonjour à tous

J'ai un problème. J'ai une molécule simple brin d'ADN et j'utilise une paire d'amorces pour amplifier une région particulière de cet molécule.
Ces amorces ont été conçues par moi avec des outils en ligne et je dois admettre que je ne suis vraiment pas un expert en matière de conception d'amorce.

Bien, (rappelez-vous que ma molécule d'ADN est simple brin) je travaille actuellement à une expérience d'amplification par cercle roulant (rolling-circle amplification, RCA).
Dans les réactions de RCA, de petits cercles monocatenaires d'ADN (ssDNA) servent d'amorce aux ADN polymérases (ou parfois aux ARN polymérases) produisant de nombreuses copies concatemerisées du cercle.
Quand une amorce complémentaire au cercle est utilisée, l'accumulation du produit est un long brin d'ADN correspondant a de nombreuse copies répétés du complémentaire de l'ADN de départ.
Une amplification (géométrique) exponentielle dite hyperbranched RCA (HRCA), également connue sous le nom de ramification ou RCA en cascade, est réalisée en utilisant une deuxième amorce avec une séquence identique à une partie du cercle d'ADN.
Puisque mon Forward primer (=droit) est complémentaire à la molécule d'ADN template, son hybridation avec cette dernière lance le processus de RCA. Mais l'autre amorce, l'amorce renversée (Reverse primer=gauche) est conçue pour être complémentaire du produit de RCA (ce qui signifie que sa séquence est identique à une partie de la molécule d'ADN template), ainsi cette amorce seule, sans la première, n'est pas censée s'hybrider au template et lancer elle aussi une RCA. La réaction est @ 30°C en isotherme.

Mais j'obtiens bien un produit de RCA (observé contre un controle sans molécule template d'ADN = aucune amplification) avec l'une ou l'autre amorce alors que sans le Forward primer, la réaction n'est pas censée se produire avec le Reverse primer seul.

Est-ce que quelqu'un a une idée au sujet de ceci ? Mon amorce Reverse primer a-t-elle pu lier à une autre partie du template d'ADN , donc agissant en tant que Forward primer?

Comment pourrais je analyser l'affinité de mes amorces pour la séquence de mon template d'ADN (des outils en ligne ? ?) ? ? ?
Si je peux savoir que ma conception d'amorce est mauvaise, je pourrai en concevoir des nouvelles… mais comment puis-je savoir ?

Un grand merci à quiconque me répondra.

Surt