recherche recette de Loading Buffer et Protocols de RT-PCR semi quantitative

[Squalor]

Bonjour à tous!

-Je suis à la recherche d'une recette de LOADING Buffer, j'en ai trouvé une sur protocol online, mais la quantitée de glycérol me parait un peu élevée...

(http://www.protocol-online.org/prot/...sts/12885.html)

Si vous avez des idées, avis ou recettes persos, c'est bien syma de me le signaler...

- Dans mon labo, Nous utilisons pour les Semi-quantitativ RT-PCR, le marquage classique avec l' Ethydium Bromide avec, après une petite photo une analyse tout aussi classique; mais j'aimerais peut etre passer à la fluorescence (Style FAM ou autres..) pour augmenter la précision.
Le problème est que je ne trouve pas de truc interressant chez nos fourisseurs habituels...

une petite idée? Un protocol, un bon plan? merci beaucoup!



Amicalement,

Greg
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[invite83298aa5]

bonjour Greg,
pour la PCR en temps reel: tu peux avoir plusieurs possibilités
en effet tu peux a partir d'un thermocycleur quantifier tes ADNc. Sans vouloir faire de pub , certains fournisseurs proposent des thermocycleurs qui analysent a chaque cycle la fluorescence dans les puits. (Ce sont des thermocycleurs pour des plaques de 96 puits en general)

Les possibilités de fluorescence sont le SYBR GREEN ou les sondes FAM-TAMRA. Le sybr green est un intercalent de l'ADN. Les sondes FAM-TAMRA sont des sondes avec un fluorescent et un agent quienscent (de part et d'autres de la sonde) : lors de ta PCR les amorces vont amplifier ton fragment et la sonde presente entre des deux amorces va etre degradée ainsi le fluorescent est libéré et quantifié.

Alors pour le SYBR GREEN tu peux le faire sans appareil spécial (et récuperer a chaque cycle un echantillon de tes puits ) mais ceci est plus long...

deuxieme chose pour le SYBR GREEN : tes amorces doivent bien choisies car tu vas amplifier aussi des zones non interessantes et comme c un intercalant tu quantifieras tout. Mais tu as un moyen de savoir si c'est du spécifique ou non rassures toi...

voila pour la RT-PCR
d'autres questions?
Laure

[invite83298aa5]

pour ton tampon j'ai aps acces...

[Squalor]

Merci, beaucoup pour les infos!

En fait je regarde plus vers une semi-quantitative (et donc non en temps réel) utilisant la fluorescence, et pas une quantitative comme tu me l'exposes (on cherche a économiser de l'argent tout en gardant une bonne qualité)

Est ce possible de faire cela avec le Syber-GREEN ou le FAM-TAMRA?

Connaissais tu des systèmes informatiques d'analyses pour ce genre de chose?

Voici la recette donnée pour le loading buffer:

9mg Bromo blue (0.09%)
9mg Xylene Cyanol FF (0.09%)
8.8mL 60% glycerol
1.2mL 0.5M EDTA


Merci beaucoup

Amicalement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[Squalor]

Oups,

petite erreur: ce n'est pas Syber GREEN, mais SYBR GREEN...

Désolé..

[wishangel]

Salut a toi,

perso pour le loading buffer j'utilise la recette du maniatis. PLusieurs types sont décrit mais moi je le prépare à 0.25% de bleu de bromo, 0.25% de xylene cyanol et 30% de glycérol. Je suis pas sur qu'il y est de recettes type mais en tout cas j'ai jamais eu de souci avec cette compo...

[Squalor]

ok,

merci bien pour la recette...

amicalement,

Greg

[invite83298aa5]

Hello pour de la semi-quantitative tu peux utiliser le sybr green c'est juste un intercalant de l'ADN. Pour info : le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides nucléiques double brin) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides nucléiques simple brin). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une sensibilité plus élevée permettant de détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques. Voilà, le SYBR GREEN est révélé aux UV comme pour un gel de BET.

Pour la semi-quantitative il faut que tu fasse une PCR avec un nombre de cycle pour lequel tu seras ds la phase exponentielle. (qui depend bien sûr de ton couple d'amorces)

@ plus

Laure