Bonjour à tous !!!
Voila je dois préparer un TP de bio cellulaire, mais je bloque sur quelques questions auquelles je ne trouve pas de réponse en surfant qur internet... Pouvez-vous m'aider? ( Il bon de savoir aussi que je suis vraiment mauvaise en bio cell....)
Alors voila : le but du tp est l'isolement de chloroplaste (épinard)
Les premières questions sont
1) Qu'apelle-t-on fractionnement cellulaire?
2) Quelles sont les principales techniques de fractionnement?
3) Pour quelles structures sont-elles utilisées?
Je n'ai trouver aucunes informations précises sur ces 3 questions..
Ensuite au niveau manipulation, on procède à une extraction et à un gradient (dont j'ai pas compris le but ^^):
On utilise pour cela: 200g de feuilles d'epinard + un milieu de broyage(saccharose 0.3M, pyrophosphate de Na 30mM, pH 7.8) que l'on broye 3fois 3 secondes.Ensuite on filtre l'extrait brut et on repartit le filtrat dans 6 tubes de 85 mL que l'on centrifuges.On elimine ensuite le surnageant puis le culot des chloroplaste est remis en suspension (suspension S1) dans 1 mL de milieu de broyage. On rassemble ensuite tous les culots dans un tube de 15 mL.
En parallèle nous effectuons un gradient : on depose 16mL de Percoll 90% dans une chambre et 16mL de tampon de lavage dans la deuxieme chambre. On ouvre un robinet de communication entre les deux chambres et on declenche une homogeneisation. On remplit des tubes (j'imagine au nombre de six ?!?) jusqu'à 25mL.
Lorsque le gradient de Percoll est terminé, on depose 1mL de S1 au sommet de chaque gradient. Les chloroplastes sonr purifiés par centrifugation sur gradient.(en parallèle on effectue une centrifugation en deposant 1mL de milieu de broyage et 15µL de marqueurs de densité colorés au somment d'un second gradient (là aussi je ne voit pas l'utilité....))
On élimine ensuite le tampon et la bande superieure corespond aux chloroplastes cassés.On récupère les bandes de chloroplastes intacts et purifiés (suspension S2).
Alors tout d'abord une question : à quoi sert un gradient?
Ensuite on en revient aux questions de mon Tp:
4) justifier le materiel de depart. (personnellement je ne vois pas quoi repondre a cette questions car on à que du materiel banal pour de la biologie...)
5) Quel materiel auriez-vous choisi pour isoler des mitochondries? (la encore n'ayant pas compris à quoi servait un fractionnement, je ne sais pas s'il faut un materiel spécifique aux mitochondries....)
6) Quel est le rôle du milieu de broyage? (j'ai trouver que la saccharose permettait de garder l'intégrité des chloroplastes, mais je n'ai rien trouver de particulier pour le reste)
7) On nous demande d'observer des chlroplastes de S1 et savoir si cette observation est suffisante pour apprécier la pureté de l'échantillon en connaissant la taille d'un chloroplaste. (J'imagine que vu la taille des chloroplastes il est impossible a l'oeil nue de vérifier cette pureté).
On nous demande alors quelle technique nous semblerait plus appropriéé?
Voila j'en arrive a la fin. Je remercie tous celles et ceux qui on eut le courage de lire jusqu'au bout cette interminable description de Tp
Et remercie encore plus fortement toutes celles et ceux qui auront pris la peine de répondre à mes questions.
Je vous assure que j'ai fait des recherches sur le net, que j'ai déjà trouver quelques informations et que toutes les questions que je vous posent ici, sont celles restées sans réponse...
Merci et bonne soirée
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Envoyé par Tekila38 
