[méthodologie] Recherche sur les prélèvement et mise en évidence des spores

[invite708f3cf8]

Bonjour

Je suis un stagiaire dans l'établissement d'Alcatel Space à Cannes et je voudrais des renseignements.

Mon maître de stage m'a donné un sujet qui me demande des recherhes extérieur, sur la biocontamination.
Voici le sujet: Améliorer et figer la procédure de prélèvement/analyse bactérien. Améliorer le temps de réponse en mesure bio.Soit en optimisant cette procédure(écouvillonage), soit avec une procédure différente.

On me damande en plus de trouver une méthode, rapide, peu onéreuse et qui ne demande pas de formation spéciale.
J'en ai conclu que la méthode qui serai la plus favorable à ses points serai la bioluminescence par ATP-Metrie, car elle procure une rapidité importante (5-10 min) par rapport au techniques classiques comme l'ecouvillonage(72h à une semaines)

Hors les micro-organismes recherchés sont des spores

J'ai donc du faire un protocole opératoire spécifique aux spores et j'aimerai que vous me donnier un avis:

Mode opératoire pour détecter spécifiquement des spores

Dans un examen d'une salle, les micro-organismes recherchés sont des spores, hors la bioluminescence révèle la présence d'ATP et donc tous les organismes vivants. Pour cela il faut rendre la méthode sélective aux spores. On connaît la résistance à la chaleur des spores c'est pour cela qu'avant de mettre les réactifs, on passera préalablement le support avec son écouvillon utilisé dans un bain-marie d'eau a 80°C pendant 25 à 35min car il s'agit d'une chaleur sèche que subissent les micro-organismes dans l'écouvillon hermétiquement fermé. Par contre on n'oubliera pas d'incuber quelques heures l'écouvillon pour activer les spores qui sortiront de leur dormance, ce qui entraînera une production d'ATP, qui sera alors révélé par la bioluminescence.

· Prendre un kit écouvillon
· Préparer le plan de travail (position du matériel sur le site)
· Retirer l'écouvillon de son tube support
· Appuyer légèrement l'écouvillon sur la surface avec un angle de 30°
. Tremper l'écouvillon dans une solution sucrée
· Mettre l'ecouvillon dans son support
· Mettre dans un bain marie 25-35min à 80°C
· Incuber quelques heure à 37]C
· Mettre les réactifs fluorochromes
· Mettre dans le luminomêtre et lire la valeur


Voila, et j aimerai, si vous le pouvez me donner quelques conseil et quelques méthodes qui serai mieux que celle-ci, car je ne suis qu'un stagiaire et je n ai pas beaucoup d'expérience (1ere année de BTS biotechnologie)

Merci
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[kinette]

Bonjour Anjis-san,
Dans le principe la méthode m'a l'air de tenir la route.
Je ne connais pas trop le principe d'ATP-métrie: la sensibilité du test est-elle si grande que ça?
Bon d'autres questions que je me pose:
- est-ce que si ton test révèle aussi les pollens, ça pose problème?
- pour certains types de spores bactériennes, est-ce que les conditions dans lesquelles tu les mets entraîneront bien une fin de dormance des spores? (et si non est-ce que l'ATP qui se trouve dans la spore sera accessible pour le test?)
- est-ce que ton test révèle aussi l'ADP? (dans le cas de consommation de l'ATP lors de la mise en conditions de levée de dormance)

De toute façon à mon avis pour t'assurer de l'efficacité de ton test, la meilleure chose à faire sera d'expérimenter...

K. t'a l'hase...

[invite708f3cf8]

(et si non est-ce que l'ATP qui se trouve dans la spore sera accessible pour le test?)

est-ce que ton test révèle aussi l'ADP? (dans le cas de consommation de l'ATP lors de la mise en conditions de levée de dormance)

bonne question: non pour l'ATP-Métrie mais on peut utilisé la NA-Metrie qui met en evidence ATP, ADP et AMP , merci de la réflection sur la levé de la dormance avec la consomation d'ATP

- pour certains types de spores bactériennes, est-ce que les conditions dans lesquelles tu les mets entraîneront bien une fin de dormance des spores?
(et si non est-ce que l'ATP qui se trouve dans la spore sera accessible pour le test?)

mmmh peut etre peut etre ps c pour ca que je demande conseil lol

- est-ce que si ton test révèle aussi les pollens, ça pose problème?

Nop spécifique au nucléotides adénélique

la sensibilité du test est-elle si grande que ça?

on ne cherche pas a avoir une superbe sensibilité mais on cherche a révéler un contamination donc en faite la sensibilité est négligeable a mon avis.

[invite708f3cf8]

Pour laccéssibilité ya pas de problème car c'est les réactif qui lyse la spore et réagissent avec l'ATP, ADP et AMP

[A voir en vidéo sur Futura]

[kinette]

Hello Anjin-san
Bon si tu sais que tes réactifs lyseront tes spores, finalement je me demande même si c'est la peine que tu aies une phase de levée de dormance dans ton test...

Par contre je pense que ton test révélera malheureusement (ou heureusement selon ce que tu souhaite) toute contamination biologique et pas seulement bactérienne (cf. la doc sur ce kit de détection d'ATP: http://www.promega.com/tbs/tb265/tb265.pdf).

Je pense que cette page t'intéressera aussi: http://www.contam-sci.com/Product/CS...inescence.html ils discutent justement du problème de la détection de cellules endommagées, et de la sensibilité des tests.

Bon tu peux lire ceci aussi:
http://www.safetyshowers.com/pages/nav/news/newsatp.htm

De toute façon il me semble qu'il n'y a pas de solution idéale: soit tu détectes un composé qui est révélateur de contamination (mais n'importe quelles contamination, y compris de choses comme des cellules mortes, du pollen, etc...), soit tu tente de faire "pousser" les organismes qui t'intéressent, mais là tu risques de ne pas détecter certaines bactéries qui ne pousseront pas dans les conditions que tu as choisi pour les détecter...
(où alors tu as besoin de techniques supplémentaires pour "trier" le matériel biologique qui t'intéresse...)

Apparemment il y aurait possibilité de faire la part antre ATP microbien et non microbien cf. la technique exposée ici:
http://science.ntu.ac.uk/external/De...sms.html#Rapid

Nowadays a constant (slowly declining) light output is achieved using lower amounts of luciferase than early formulations which resulted in a flash of light. For hygiene testing the total ATP content of the sample is determined. This will include eucaryotic and microbial ATP. To determine the microbial ATP level selective extraction is used. First, non-microbial ATP is extracted with a non-ionic detergent (Triton X-100) and then destroyed by treating with a high level of (typically) potato ATPase for 5 minutes. Subsequently the microbial ATP is extracted using either trichloroacetic acid (5%), an organic solvent (ethanol, acetone or chloroform) which will require subsequent dilution to avoid luciferase inhibition or cationic detergents. Careful timing of mixing and reading is required to allow for luciferase inhibition (Simpson & Hammond, 1991). Since the level of ATP in eucaryotic cells is three orders of magnitude greater than bacterial cells this procedure is difficult to achieve reliably.

Bon, voilà ce que j'ai trouvé, mais je ne suis pas vraiment "spécialiste" du domaine, et je pense que d'autres habitués de Futura seront plus à même de te conseiller.

K. va lier...

[invite708f3cf8]

Super merci pour la doc ca va vraiment bocoup m aider

G un truc a dire par rapport a ca:

Par contre je pense que ton test révélera malheureusement (ou heureusement selon ce que tu souhaite) toute contamination biologique et pas
seulement bactérienne (cf. la doc sur ce kit de détection d'ATP

Ben c pour ca que je passe mon echantillon 35 min a 80°C c pour rendre sélectif le test vic à vis des spores, car grace a leur resistance thermique après le chauffage il ne restera que des spore

Pi on ne peu pas directement faire le test avant la levé de dormance car il n 'y a pas assez d'ATP pour les mettre en évidence. C'est pour cela qu'il fo les réactiver!!

[John78]

Salut

Tu cherches des contaminations sur quelles surfaces exactement ?
Et surtout pourquoi des spores ?

A+
J

[invite708f3cf8]

Sur un epu tout comme surface, mais surtout le sol... des salles blanches types 100000 et 100

Les spores car ce sont les organisme les plus résistants et donc qui resiste au détergent, lors du néttoyage du sol on sait que les Bactérie, cellules, Protozoaire, amibes et autre sont détruite, mais pas les spores d'où cette recherche de contamination pas les spores, pour pouvoir stoppé la production et mettre fin a la contamination par des technique plus puissante, tout en enlevent le matériel qui risquerai d etre endommagé

[John78]

Il y a un truc que je ne comprends pas. Si ta surface de départ est effectivement exempte de microorganisme car traitée avec un détergent (hypothèse forte !) pourquoi chauffer à 80°C ton prélèvement ?

Ensuite je ne comprends pas l'étape sur "milieu sucré". Si tu veux réveiller "les spores" pour produire des bactéries pourquoi éliminer les bactéries qui ont donné ses spores auparavant en chauffant ?
Ensuite il n'est pas certains que ce milieu soit adapté pour réveiller et mettre en culture ces bactéries sporulantes. On sait cultiver moins de 1% de la biodiversité microbienne, tu va grandement minorer ta contamination !

A+
J

[invite708f3cf8]

je passe a 80°C pour eliminer les autre micro organisme au cas où. car une étude avais montrer que quelques fois mais rarement les néttoyage n'été pas du tout suffisant car l'utilitaire trop souillé?

donc il ne reste que des spores théoriquement

Comme une spore et en dormance donc pas de métabolisme d'ou très peu d'ATP, ADP AMP

on réactive donc production d'ATP et ADP dosable par la bioluminéscence