transfection

[val62]

bonjour à tous,

Voilà dans le cadre d'un projet en apprentissage je dois rendre un rapport sur les differentes méthode de transfection. Le probleme c'est que je ne sais pas par quoi commencer donc si pouviez me donner un petit coup de main en me donnant des adresses internet ou en me disant ce que vous savez sur la transfection leurs avantages, leurs inconveniant etc ...
J'espère que vous pourrez m'aider. Merci d'avance

[MaliciaR]

Bonsoir,
Ca s'appelle te faire un plan détaillé et pratiquement tout ce que tu as à faire...
Pas très constructif. Les sites se trouvent par Google, tu peux le faire comme le ferait tout un chacun parmi nous
Donc, essaie de faire un plan, de "jeter" les idées et connaissances que tu as sur le sujet. Ensuite, si tu as des questions précises, reviens vers le forum.

Cordialement,

[futurelight]

j'ai téléchargé ce document il y a longtemps
j'ai perdu le lien,
voici la partie sur la transfection

bon courage


Transformation-transfection
Comment faire rentrer un ADN dans une cellule ?
Il existe différentes techniques qui permettent de faire pénétrer de l’ADN dans une cellule
eucaryote. Dans tous les cas, le but est de traverser la membrane cytoplasmique. Une fois dans le
cytoplasme de la cellule, l’ADN sera transporté dans le noyau par un mécanisme non contrôlable. Le
choix de l’une ou l’autre de ces techniques est essentiellement fonction de la sensibilité des cellules,
de l’efficacité de transfection recherchée et de l’objectif exact de l’expérience. Une cellule dans
laquelle on a fait entrer un ADN est une cellule transfectée.
- La microinjection. Des microaiguilles sont fabriquées par étirement d’un tube de verre à la
chaleur.
- Le dextran/DEAE. On a couplé un groupement chimique chargé positivement
(diéthylaminoéthyl) au dextran qui est un hydrate de carbone polymérique. Le mécanisme par lequel
le dextran/DEAE permet à l'ADN d'atteindre les noyaux des cellules est mal connu.
Conventionnellement, on admet que les complexes d'ADN-dextran/DEAE collent à la surface des
cellules et sont internalisés par endocytose.
- Le phosphate de calcium. La plus ancienne des techniques de transfection. Cette méthode
donne de meilleurs rendements que le dextran/DEAE. Elle consiste à faire rentrer l'ADN via une coprécipitation
PO4Ca /ADN qui adhère à la surface des cellules. Cette technique est basée sur le fait
que les cations divalents tels que le calcium ou le magnésium favorisent la pénétration de l'ADN dans
les cellules. Elle nécessite d’autre part d’utiliser des cellules adhérentes qui présentent une forte
activité d'endocytose. Les principaux problèmes liés à cette technique sont de trois ordres : i) le
calcium est toxique pour certaines cellules ii) beaucoup de copies sont transfectées par cellule –
plusieurs dizaines iii) l’expression du gène rapporteur est retardée d’environ 72h .
- L’électroporation (ou électroperméabilisation) : Cette technique consiste à placer les
cellules dans un champ électrique qui ouvre des pores dans la cellule, on pense que l'ADN rentre par
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ces pores par diffusion. Cette méthode s’applique aux cellules adhérentes ou en suspension ; il n’y a
pas de retard d'expression du gène rapporteur ; peu de copies sont transfectées.
- Les liposomes : on fait des liposomes en utilisant des lipides chargés positivement. Ces
liposomes forment des agrégats avec l'ADN (chargé négativement). Les liposomes ayant une charge
globale positive sont attirés par la membrane cellulaire de charge globalement négative. Le liposome
rentre dans la cellule par endocytose. Après destruction des endosomes, l’ADN se retrouve dans le
cytoplasme et lors d’une division cellulaire peut se retrouver dans le noyau (Zabner et al., 1995). Il y
a actuellement de nombreux lipides capables de former des liposomes cationiques sur le marché. Le
premier qui a été mis au point est un mélange de DOTMA et de DOTE.
- Les peptides : Un peptide amphiphile dérivé de la troisième hélice de la protéine
antennapedia de la drosophile est capable d’être internalisé dans les cellules sans passer par la voie de
l ‘endocytose. Si on synthétise ce peptide avec une queue polylysine, le peptide accroche l’ADN par
liaison électrostatique et rentre dans la cellule avec l’ADN (Citti et al., 2002).
Comment faire rentrer une protéine dans une cellule ?
- Microinjection : on peut injecter des protéines dans les cellules en utilisant des aiguilles
effilées, cependant cette technique demande de l’habileté et on doit injecter les cellules une à une.
- Electroporation : l’électroporation utilise un fort voltage qui produit des pores transitoires.
Cette méthode peut être utilisée sur des populations cellulaires mais n’est pas spécifique, les autres
composants du milieu de culture rentrent dans la cellule. Un autre inconvénient de l’électroporation
est son efficacité très variable en fonction du type cellulaire.
- Liposomes : Les liposomes sont très efficaces pour transporter l’ADN, mais pour la
plupart, restent peu efficaces pour les protéines. Cependant Gene Therapy System Inc a développé
une formulation de lipides qui interagit avec les protéines et permet leur internalisation. De tels
lipides sont commercialisés par Perbio.
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- Les peptides : Il a été observé que quelques protéines peuvent entrer dans les cellules. L’analyse du
mécanisme à mis en évidence que l’internalisation était due à des petits peptides qui peuvent
traverser la membrane plasmique et entraîner le reste de la protéine. Les trois peptides les plus
utilisés sont dérivés du facteur de transcription Antennapedia de la drosophile, de la protéine VP22
du virus de l’Herpes et de l’activateur transcriptionnel Tat du virus HIV. Ce sont de petits peptides de
10-16 résidus qui comportent de nombreux acides aminés basiques. Par exemple le peptide de Tat
présente la séquence suivante : RKKRRQRRR. A partir de ces séquences (Ho et al., 2001) de
nombreux peptides synthétiques ont été construits. L’entrée des protéines est indépendante de
l’endocytose comme de la taille de la protéine à la condition que la protéine soit liée de façon
covalente au peptide.
- Les protéines transportrices : Pep-1 est une protéine de 21 résidus qui est composé de 2 domaines, un
domaine hydrophobe, riche en tryptophane il favorise l’interaction avec la protéine à transporter et un
domaine riche en lysine dérivé du virus SV40 qui permet l’entrée dans la cellule et permet la
solubilité du peptide.

[Yoyo]

salut

c'est sympa de donner les informations, mais bon ca n'est pas franchement tres interessant de faire l'excercice a la place de celui qui pose la question.
Il est toujours plus profitable et plus pedagogique de laisser la personne reflechir elle meme comme le fait MaliciaR

Yoyo