extraction d'ARN

[invite810d9eff]

Bonjour tout le monde
je suis un nouveau membre.
avant de poser ma question je vous souhaite d'abord une excellente année 2008.
je travaille actuellement sur l'extraction d'ARN à partir des leucocytes. j'ai pu avoir de bons rapport DO260/280 mais le probléme que j'ai conserne l'absorbance à 230 nm qui est trés élevée et donc mes rapports 260/230 sont trop faibles (0,...). Je sais que ceci peut être due à une contamination par le phénol mais j'aimrais savoir s'il existe d'autres explications à ça et est ce que l'éthanol absorbe à 230 nm?
merci
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[jmbowie]

Bonjour tout le monde
je suis un nouveau membre.
avant de poser ma question je vous souhaite d'abord une excellente année 2008.
je travaille actuellement sur l'extraction d'ARN à partir des leucocytes. j'ai pu avoir de bons rapport DO260/280 mais le probléme que j'ai conserne l'absorbance à 230 nm qui est trés élevée et donc mes rapports 260/230 sont trop faibles (0,...). Je sais que ceci peut être due à une contamination par le phénol mais j'aimrais savoir s'il existe d'autres explications à ça et est ce que l'éthanol absorbe à 230 nm?
merci

Je serai très étonné que l'éthanol absorbe à 230nm! Pour le phénol pourquoi pas, puisque ce sont les groupements aromatiques qui absorbent à 230nm et que le phénol en contient un.

[invite810d9eff]

Je serai très étonné que l'éthanol absorbe à 230nm! Pour le phénol pourquoi pas, puisque ce sont les groupements aromatiques qui absorbent à 230nm et que le phénol en contient un.

merci pour ta réponse.
moi aussi je pense la même chose mais j'avais lu sur un site que les produits organiques (guanidine thiocyanate, phénol, éthanol....) pouvait être respnsables d'une DO élevée à 230 nm c'est ce qui m'a poussé à penser à l'éthanol.

[emma59]

Bonjour!

Bonne année 2008 également!

J'ai également une absorbance à 230 nm élevée avec mon extraction d'ARN au TRIzol. J'ai lu aussi que c'était surtout une contamination en sels et partiellement au phénol mais pas à l'éthanol.
Je voulais savoir si vous aviez réalisé un lavage supplémentaire au chloroforme et si l'absorbance à 230 en était dimnuée.

Amicalement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite810d9eff]

Bonjour!

Bonne année 2008 également!

J'ai également une absorbance à 230 nm élevée avec mon extraction d'ARN au TRIzol. J'ai lu aussi que c'était surtout une contamination en sels et partiellement au phénol mais pas à l'éthanol.
Je voulais savoir si vous aviez réalisé un lavage supplémentaire au chloroforme et si l'absorbance à 230 en était dimnuée.

Amicalement

Bonjour
en fait j'ai pas rajouté un lavage au chloroforme; moi je travail avec un kit d'extraction de PROMEGA (RNAgents Total RNA Isolation System) et je pense qu'il faut éviter de trop manipuler l'ARN car il risque de se degrader surtout si on travail dans des conditions qui ne sont pas vraiment adapté à ce type de manipe et c'est mon cas.
et toi tu l'as essayé?

[emma59]

Bonjour,

Excusez-moi pour répondre si tard...

J'ai essayé plusieurs protocoles d'extraction d'ARN car je travaille sur l'ARN circulant plasmatique et j'essaye d'optimiser mon rendement d'ARN avant d'agir sur la contamination par les sels ou le phénol.
J'ai du mal à avoir d'aussis bons résultats que dans les articles avec la même quantité de plasma...)
J'ai juste remarqué qu'en travaillant sur des échantillons congelés dans le TRIzol, j'avais un meilleur rendement que si je les traitais de suite après le prélèvement. Le fait de chauffer les échantillons pour favoriser la dissolution des sels avant extraction augmenterai mon extraction d'ARN. Je n'ai pas pu faire un agilent encore pour visualiser la différence de qualitécar je dois sous-traiter mais j'ai déplacé mon pic de 230 vers 220 nm. Cependant j'essaierai quand même l'étape au chloroforme supplémentaire même si j'obtient des résultats PCR assez correct avec mon ARN actuel.

Amicalement

[invite810d9eff]

mercipour ta réponse.
j'avais une autre question à poser concernant le ph du phénol utilisé. Normalement ce ph doit aux allonteur de 7 mais le mien il a un ph entre 2 et 3 peut être que la solution est périmée. je ne peux pas le savoir puisqu'il y a aucune date sur le flacon.
est ce que tu peux me renseigner sur ça?
merci d'avance

[Yoyo]

c'est clair que les ARN n'aiment pas du tout les pH acide....il vaux mieux changer de phenol!

YOyo

[jmbowie]

mercipour ta réponse.
j'avais une autre question à poser concernant le ph du phénol utilisé. Normalement ce ph doit aux allonteur de 7 mais le mien il a un ph entre 2 et 3 peut être que la solution est périmée. je ne peux pas le savoir puisqu'il y a aucune date sur le flacon.
est ce que tu peux me renseigner sur ça?
merci d'avance

Il a changé de couleur à ce pH non?

[emma59]

Hello!

(Désolée pour les fautes d'orthographe; je devrais écrire moins vite)

Je n'utilise pas le phénol seul mais du TRIzol. Je n'ai pas vérifié le pH car il est presque neuf. Je ne crois pas pouvoir t'éclairer si je prends le PH de mon TRIzol mais je peux toujours le faire en début d'AM.
Cependant, ça n'empêche pas un pic à 220-230 en ce qui me concerne.
Il s'agit aussi d'une contamination en sel à 230 pas que du phénol.

Amicalement

[invite810d9eff]

merci pour vos réponses

[invite810d9eff]

Il a changé de couleur à ce pH non?

merci pour votre réponse mais je l'ai pas bien comprise. Pouvez vous me donner plus d'explications?

[invite810d9eff]

Hello!

(Désolée pour les fautes d'orthographe; je devrais écrire moins vite)

Je n'utilise pas le phénol seul mais du TRIzol. Je n'ai pas vérifié le pH car il est presque neuf. Je ne crois pas pouvoir t'éclairer si je prends le PH de mon TRIzol mais je peux toujours le faire en début d'AM.
Cependant, ça n'empêche pas un pic à 220-230 en ce qui me concerne.
Il s'agit aussi d'une contamination en sel à 230 pas que du phénol.

Amicalement

merci bien c'est trés gentil de votre part.

[emma59]

Hello!

Pour info, le pH de mon TRIzol est de 4,3 et il date de décembre. Or, il contient en plus du phénol de l'isothiocyanate de guanidine donc je ne sais pas si tu peux comparer avec ton phénol.
Je ne connais pas la technique de Promega que tu utilises: toutes les solutions sont fournies dans un Kit?
En ce qui me concerne je pratique la technique du TRIzol INVITROGEN et ensuite je traite la phase aqueuse soit par la précipitation à l'isopropanol soit par passage sur colonne Qiagen avec ou sans carrier (vu qu'il y a très peu d'ARN dans le plasma comparé à des cellules ou des tissus).
Mes résultats diffèrent plus ou moins alors je continue les modif mais le service tecnique de Qiagen m'a dit que le pic obtenu à 230 après passage sur colonne correspondait à une contamination par les sels de départ.
Tiens moi au courant si tu progresses dans la qualité de tes extractions.
Bon week end
Amicalement

[invite810d9eff]

Hello!

Pour info, le pH de mon TRIzol est de 4,3 et il date de décembre. Or, il contient en plus du phénol de l'isothiocyanate de guanidine donc je ne sais pas si tu peux comparer avec ton phénol.
Je ne connais pas la technique de Promega que tu utilises: toutes les solutions sont fournies dans un Kit?
En ce qui me concerne je pratique la technique du TRIzol INVITROGEN et ensuite je traite la phase aqueuse soit par la précipitation à l'isopropanol soit par passage sur colonne Qiagen avec ou sans carrier (vu qu'il y a très peu d'ARN dans le plasma comparé à des cellules ou des tissus).
Mes résultats diffèrent plus ou moins alors je continue les modif mais le service tecnique de Qiagen m'a dit que le pic obtenu à 230 après passage sur colonne correspondait à une contamination par les sels de départ.
Tiens moi au courant si tu progresses dans la qualité de tes extractions.
Bon week end
Amicalement

salut
Merci infiniment pour ta coopération.
le kit que j'utilise contient toute les solutions nécessaires pour l'extraction à part le mélange: phénol-chloroforme-alcool isoamyl. ce mélange je le prépare moi même.
Je vais essayer d'avoir une nouvelle solution phénol et je te tiendrai au courant des nouvelles.
bon weekend également.

[emma59]

Bonjour, j'espère que vous allez bien!

Juste pour vous dire que j'ai retenté une extraction d'ARN en faisant un lavage supplémentaire au chloroforme et mon rapport DO 260/230 est passé de 0,4 à 1 donc nette amélioration. J'ai dû cependant compenser la perte de rendement d'ARN en partant d'une quantité d'échantillon de 30% supérieure. J'ai toujours un rapport DO 260/280 trop élevé (aux alentour de 3 au lieu de 2) et je me demande pourquoi mais bon... j'ai remarqué du non spécifique en PCR, j'espère aussi réguler cela avec cette diminution de contamination à 230.
Voilà les nouvelles.
Amicalement

[Andy_21bio]

Bonjour, cette discussion date donc j'espère que quelqu'un lira quand même. J'utilise la méthode au trizol pour extraire mon ADN de cellules lymphocytaires, et je cherche à comprendre exactement de quel manière se déplace l'ADN, l'ARN et les prot à chaque ajout, mais surtout pourquoi (principalement concernant l'ADN et l'ARN puisque ce sont des molécules similaires) ?
Plus en détail : j'ajoute à mes cellules 500µL de trizol, je vortexe, je centrifuge. J'ajoute ensuite du chloroforme, mêmes étapes de vortex et de centrifugation. Puis, je récupère la phase supérieur transparente (et c'est là que j'ai du mal à comprendre la manière dont les choses se déroulent).
Merci d'avance !

[Yoyo]

Salut

Le phénol sépare les molécules organiques (donc les protéines) des acides nucléiques. Les molécules hydrophiles se retrouverons dans la phase aqueuse (l'eau) les protéine insoluble seront à l'interphase phneol/eau et le reste dans le phénol.

Yoyo

[Andy_21bio]

J'ai bien compris cela, mais en quoi l'ARN est différent de l'ADN ? puisque j'ai trois phases au final : la phase organique, rose contenant les protéines, la phase aqueuse contenant l'ARN et au milieu, la phase intermédiaire qui correspond à l'anneau d'ADN...
Merci d'avoir répondu en tout cas !

[Yoyo]

Salut

Désolé mais tu te trompes, le trizole ne permet pas de séparer l'ADN de l'ARN. les protéines ne sont pas dans la phase phénolique mais dans l'anneau dont tu parles à l'interphase avec la phase aqueuse qui contien tous les acides nucléiques.

YOyo

[Andy_21bio]

J'ai dû mal m'exprimer, je sais que le trizol ne permet pas de les séparer, mais qu'il lyse seulement les cellules. Au labo dans lequel je suis on m'a pourtant expliqué que le colorant présent dans le trizol était soluble dans les solvant organique, ce qui fait qu'il se retrouve en bas (puisque visuellement j'ai bien une phase organique rose), que l'anneau du milieu représentait l'ADN, et la phase aqueuse en haut regroupait les ARN...

[Yoyo]

Salut

Eh ben je ne suis pas d'accord avec ce qu'ils t'ont dit.
La phase organique est en bas contient les protéines et les débris, l'anneau blanc à l'interphase ce sont encore des protéines et des lipides, et dans la phase acqueuse il y a TOUS les acides nucléiques.
Yoyo

[ChegueMorel]

Bonjour,la contamination a cette absorbante peut etre due a des ions phénolates ou thiocyanates. Merci