Western blot

[inviteec077029]

Bonsoir,

J'ai quelques questions concernant le Western blot,

L'incubation de la membrane de nitrocellulose avec le methanol est important avant le transfert même si aujourd'hui on à des membranes d'assez bonnes qualité???

Selon si le transfert et semi sec ou non pourquoi il y a t'il des variations dans la composition de tampon des grosses variations parfois même il mettent un peu de SDS pour essayer d'augmenter le transfert mais bon.
qu'est ce qu'il est le mieux?

Quelqu'un peut-il me donner exactement un protocole pour preparer un gel de 8% . Moi le SDS je le met au moment de la préparation de mon gel ,d'autres personnes le met dans les tampon de séparation et de concentration
qu'est ce qu'il est le mieux?

Le tampon de saturation de la membrane BSA lait ou....

Donné moi un protocole ultra-optimisé SVP sa serait super sympa
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[Yoyo]

salut

Il n'y a pas de protocole ideal justement!
chacun a sa sauce, BSA ou lait ca depent de la propreté de ton anticorps et de sa specificité.

Les membranes de nitro sont tres hydrophobes, le passage en methanol permet de les "mouiller" si tu ne le fais pas tu n'arriveras pas a transferer tes proteines.

Mettre du SDS permet de bien dénaturer les proteines lors des migrations/tansfert.

YOyo

[invitec83cf65d]

Bonjour,

L'incubation de la membrane de nitrocellulose avec le methanol est important avant le transfert même si aujourd'hui on à des membranes d'assez bonnes qualité???

Les membranes de PVDF doivent être "mouillées" en méthanol. Si tu ne le fais, ton transfert ne marchera pas. Par contre, il me semble que la nitrocellulose n'a pas besoin d'être trempées dans le méthanol.

Selon si le transfert et semi sec ou non pourquoi il y a t'il des variations dans la composition de tampon des grosses variations parfois même il mettent un peu de SDS pour essayer d'augmenter le transfert mais bon.
qu'est ce qu'il est le mieux?

Je n'ai pas comparé les modes de transfert.
Tampon de saturation: attention, ne JAMAIS utiliser de lait pour saturer des membranes qui seront incubées avec des anticorps anti-phosphotyrosine. Le lait contient des phosphatases, alors tu vas perdre ton signal. Sinon, comme le dit Yoyo, il n'y a pas de protocole idéal. Mais le lait marche bien en général (et c'est moins cher que la BSA .

Bonne journée

[gorben]

Salut,

Les membranes de nitro sont tres hydrophobes, le passage en methanol permet de les "mouiller" si tu ne le fais pas tu n'arriveras pas a transferer tes proteines.

Desole mais ce n'est pas vrai ! Je fais TOUS mes transferts sur nitro sans utiliser de methanol (qui est tres toxique et qui necessite d'etre recycle comme un solvant !)
Evidemment, la membrane ne se mouille pas aussi vite qu'avec du methanol, mais generalement je l'equilibre 5 min avant le transfert et mes blots sont nickel.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

Salut,



Desole mais ce n'est pas vrai ! Je fais TOUS mes transferts sur nitro sans utiliser de methanol (qui est tres toxique et qui necessite d'etre recycle comme un solvant !)
Evidemment, la membrane ne se mouille pas aussi vite qu'avec du methanol, mais generalement je l'equilibre 5 min avant le transfert et mes blots sont nickel.

A+

Corsette m'avais correctement corrigé. Ce n'est pas en effet pour la nitro mais pour le PVDF qu'il faut faire cette etape d'incubation, au temps pour moi

YOyo

[LXR]

Malgré que cette description de la technique du western blot ne soit pas exhaustive (difficile en biologie), elle est très pédagogique : Western Blot

Greg

[invite791e1f8f]

Malgré que cette description de la technique du western blot ne soit pas exhaustive (difficile en biologie), elle est très pédagogique : Western Blot

Greg

Merci de citer mon site, ca me fait sincèrement plaisir, j'en profite par la même occasion pour signaler un changement d'adresse, vous pouvez désormais le retrouver le site sur :
http://www.cours-de-biochimie.fr/
Évidemment l'ancienne adresse reste toujours valide.

Cordialement

Vincent MASSON