Help! tp génétique, analyse clonage

[tite_toile]

Bonjour,

J'ai quelques questions à poser au sujet d'un tp de génétique qui m'embêtes pour mon compte-rendu
En fait, on a réalisé une transformation de bactéries pour les rendre compétentes, puis on les a clonées.
La ligation de l'insert s'est fait au niveau du gène lacZ d'un plasmide. On sélectionne les clones par ensemencement sur différentes boites.
On a donc fait fait un contrôle négatif (sans ADN) dans lequel on a juste ensemencé une suspension de cellules compétentes dans du LB agar
J'arrive pas à expliquer pouquoi le témoin sera négatif (on a eu 0colonies)

Ensuite on a aussi fait un test de compétence avec encore une suspension de cellules compétentes à laquelle on ajoute du plasmide pur. Le tout est ensemencé sur une boite de Lb agar.
On me demande de calculer la compétence des cellules: nombre de colonies/ microgrammes d'ADN. mais je ne vois pas trop d'où vient le plasmide pu en quoi cest un test de compétence
Apres j'arrive bien a expliquer les coloniies blanc/bleu sur Xgal...
J'epsère que vous m'avez compris. Merci de votre aide

[IngDr]

En gros t'as rien compris à ton TP. Fait attention à la définition des termes que tu emploies.
ca manque un peu d'infos, car ton milieu LB agar doit contenir dans une de tes manip un antibiotique, qui permet de sélectionner les bactéries transformées.
Ces bactéries avec plasmides sont dites resistantes et vont pousser sur milieu sélectifs. ==> Les bactos transformés par rien ne poussent pas sur ce milieu = controle négatif
L'efficacité de transfo = nombre de bactéries avec plasmides /ug d'ADN.==> bacto sur milieu sélectif / quantité d'ADN utilisé pour la transfo. Tenir compte de la dilution éventuelle des bactos avant étalement.
Ca te permet de voir combien de bactos peuvent être transformées avec 1 ug d'ADN. En général, ca peut atteindre 10^7-10^8.
Compétence = capacité a être tranformée.

Le gène LacZ code une protéine permettant de convertir le X Gal en un substrat de couleur bleue. Si ton clonage (insertion du gène) ne permet plus la synthèse de cette protéine, et ben tes bactos sont blanches.

Cordialement,

[MaliciaR]

Bonjour,

Je crois qu'il y a quelques notions de base que tu as mal saisies...

En fait, on a réalisé une transformation de bactéries pour les rendre compétentes, puis on les a clonées.

Comment les bactéries sont-elle rendues compétentes? Par quelle technique? Et qu'est-ce que la transformation précisément?
Vous avez cloné les bactéries, es-tu sûre?

Ou plutôt les bactéries étaient compétentes (électro- ou thermocompétentes) et vous avez fait une transformation avec vos plasmides recombinants au sein desquels vous aviez auparavant cloné un insert?

La ligation de l'insert s'est fait au niveau du gène lacZ d'un plasmide. On sélectionne les clones par ensemencement sur différentes boites.

Voici une chose très claire : votre insert vient interrompre le gène lacZ.
Quelles en seront les conséquences? (Tu dis plus bas avoir bien compris le système béta-gal/substrat chromogène, donc vas-y, explicite ).

On a donc fait fait un contrôle négatif (sans ADN) dans lequel on a juste ensemencé une suspension de cellules compétentes dans du LB agar
J'arrive pas à expliquer pouquoi le témoin sera négatif (on a eu 0colonies)

Sans ADN? Tu veux dire que ce sont des cellules compétentes non transformées avec le plasmide recombinant Il vaut mieux que tu écrives d'une manière plus claire et précise

Et donc, que peux-tu dire? Quelle est la composition exacte de ton milieu? Et quels autres gènes contient ton plasmide?

Ensuite on a aussi fait un test de compétence avec encore une suspension de cellules compétentes à laquelle on ajoute du plasmide pur. Le tout est ensemencé sur une boite de Lb agar.
On me demande de calculer la compétence des cellules: nombre de colonies/ microgrammes d'ADN. mais je ne vois pas trop d'où vient le plasmide pu en quoi cest un test de compétence.

Ce que tu fais c'est que tu transformes tes colonies avec le plasmide natif (= non recombinant = sans insert). Tu veux vérifier que les cellules l'ont bien intégré donc tu les étales sur une boîte contenant du LB agar et ... (un antibiotique, non? ).
Ce serait mieux que tu répondes à ces questions d'abord avant de te poser la question du calcul

Cordialement,

P.S. Grillée par IngDr (j'écris vraiment lentement, ces temps-ci )

[tite_toile]

Bonsoir,

Tour d'abord merci de votre aide, ça m'a permis de bien avancer.
Il est vrai que je n'ai pas tout le temps été très clair, mais jje ne voulais pas marquer un roman, enfin il y avai des trucs évident (style lantibio...) que j'ai oublié de rappeler...
Pourriez vous me dire pourquoi on utilise de l'IPTG pour la sélection blanc/bleu
Je sais qu'il est un promoteur inductible non dégradable mais cest assez flou...
Est ce que c'est pour assurer qu'il n'y est pas de répression?! Je dis surement des bêtises enfin ça me tracasse bien!!
Je profite du forum pour poser des questions pratiques que je me pose parfois Je cherche svt dans les bouquins mais dans la masse d'info je me perd rapidement et ne retient pas l'info.
Questions: jJe crois que je faisais une erreur en associant la transformation des bactéries et leur compétences. Quest ce qu'une cellule compétente? C'est une cellule transformée?
Et mnt la ptite dernière le polylinker et le MCS c'est la même chose non? Ou le polylinker est dans le MCS?
Merci d'avance

[MaliciaR]

Bonjour,

Il est vrai que je n'ai pas tout le temps été très clair, mais jje ne voulais pas marquer un roman, enfin il y avai des trucs évident (style lantibio...) que j'ai oublié de rappeler...

Beh tu es la seule à le penser! Lorsque l'on pose des questions sur les résultats obtenus en suivant un protocole il est pour le moins souhaitable de préciser le protocole...

Pourriez vous me dire pourquoi on utilise de l'IPTG pour la sélection blanc/bleu
Je sais qu'il est un promoteur inductible non dégradable mais cest assez flou...

Non! L'IPTG est l'inducteur du promoteur tac (un promoteur artificiel dérivé du P/O_lac), au même titre que le lactose est l'inducteur du P/O_lac ... Donc, si tu comprends le système blanc/bleu, tu sauras de quoi je parle

Questions: jJe crois que je faisais une erreur en associant la transformation des bactéries et leur compétences. Quest ce qu'une cellule compétente? C'est une cellule transformée?

Une bactérie compétente est dans ce cas précis une bactérie dont la membrane (ou la paroi) a été rendue perméable d'une telle manière qu'elle permet l'entrée d'ADN double-brin. Les façons les plus courantes sont l'électroporation (un choc électrique fait que la paroi/membrane sera "trouée") ou le choc thermique (même résultat, mais en appliquant des T°C différentes).

Une bactérie transformée est une bactérie ayant été rendue compétente et qui a intégré un ADN double-brin Lequel est dans ton cas...

Et mnt la ptite dernière le polylinker et le MCS c'est la même chose non? Ou le polylinker est dans le MCS?
Merci d'avance

A ton avis, c'est la même chose ou pas?

Ce serait sympa que tu répondes aux questions qu'on te pose parce que ce sont des choses que tous les étudiants en bio croisent durant leur cursus et c'est toujours intéressant de lire ce que d'autres ont pensé. On est sur un forum

Cordialement,

[tite_toile]

je pense sincèrement avoir compris la sélection blanc/bleu vu que j'ai fait une explication sur mon TP et que j'ai demandé à mon prof de me le corriger.Il ma dit que c'était bon par contre je ne comprend ce que tu me dit sur l'IPTG je suis sûr que mon prof par dit que c'était un promoteur inductible, alors peut-être que c'était pas aussi précis que toi et qu'il nous a dit ca pour simplifier le truc.
Nos cellules sont rendues compétentes par l'ajout de CaCl2 et choc de chaleur afin de faciliter la transfo.
A mon avis polylinker et MCS c'est la même chose

[MaliciaR]

je pense sincèrement avoir compris la sélection blanc/bleu vu que j'ai fait une explication sur mon TP et que j'ai demandé à mon prof de me le corriger.Il ma dit que c'était bon par contre je ne comprend ce que tu me dit sur l'IPTG je suis sûr que mon prof par dit que c'était un promoteur inductible, alors peut-être que c'était pas aussi précis que toi et qu'il nous a dit ca pour simplifier le truc.

Il a tellement simplifié que c'est faux.

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, abbreviated IPTG, is a molecular biology reagent.

This compound is used as a molecular mimic of allolactose, a lactose metabolite that triggers transcription of the lac operon. Unlike allolactose, the sulfur (S) atom creates a chemical bond which is non-hydrolyzable by the cell, preventing the cell from "eating up" or degrading the inductant.

IPTG induces activity of beta-galactosidase, an enzyme that promotes lactose utilization, by binding and inhibiting the lac repressor. In cloning experiments, the lacZ gene is replaced with the gene of interest and IPTG is then used to induce gene expression.

A mon avis polylinker et MCS c'est la même chose

Oui Et qu'est-ce alors ?

Cordialement,

[tite_toile]

A mon avis, le polylinker offre au vecteur tout un choix de restriction uniques, c’est-à-dire tous différents les uns des autres et n’existant pas, par ailleurs, dans ce vecteur.
Grâce au polylinker, le fragment d’ADN étranger, pourra donc être inséré à l’endroit voulu.

Maintenant si je dit que pour l'IPTG c'est un inducteur qui assure l'activité de la bêta-galactosidase en inhibant l'expression du gènerépresseur dans l'opéron c'est bon?
Mercii bcp de l'aide

[MaliciaR]

A mon avis, le polylinker offre au vecteur tout un choix de restriction uniques, c’est-à-dire tous différents les uns des autres et n’existant pas, par ailleurs, dans ce vecteur.
Grâce au polylinker, le fragment d’ADN étranger, pourra donc être inséré à l’endroit voulu.

Il faut que tu cites le site d'où provient ton info

Maintenant si je dit que pour l'IPTG c'est un inducteur qui assure l'activité de la bêta-galactosidase en inhibant l'expression du gènerépresseur dans l'opéron c'est bon?

Tu veux dire quoi?


Cordialement,

[tite_toile]

lol pour la citation sa vient de mon TP^^!!!!!
Je voudrais expliquer pourquoi je dois rajouter de l'iptg dans le milieu pour la sélection blanc/bleu

[MaliciaR]

lol pour la citation sa vient de mon TP^^!!!!!

Tant mieux, je l'ai dit parce que j'ai vu un site où le gars expliquait ce qu'est un polylinker de la même manière que toi

Je voudrais expliquer pourquoi je dois rajouter de l'iptg dans le milieu pour la sélection blanc/bleu

J'ai compris que tu dois expliquer le rôle de l'IPTG. Mais je n'ai rien compris à ta phrase... Tu peux l'écrire un peu plus clairement?

Cordialement,

[ptitsouris]

bonjour
j'ai moi aussi quelques problèmes de compréhension par rapport au rôle de l'IPTG. merci pour les explications déjà dites, et pour la citation...mais comme je ne suis pas une as en anglais, j'aimerais être sûre d'avoir compris...
Ce que je sais, c'est que quand on insert un fragment d'ADN, on s'arrange souvent pour le mettre en plein dans LacZ, qui code pour la beta-galactosidase. Comme il ne peut plus produire cette enzyme, le lactose n'est plus dégradé.
Là, si j'ai bien compris, on utilise l'IPTG à la place du lactose, parce qu'il lui ressemble beaucoup, et qu'il n'est pas dégradable par la cellule. Celles qui ont un plasmide sans ADN ont leur gène complet et l'utilisent à la place du lactose, normalement. Et celles qui ont un insert ne peuvent pas, donc il y reste. Et comme il est de couleur bleue, on peut repérer celle qui l'ony utilisé ou non.
Si cette explication est bonne, je me pose une autre quetion : on nous a parlé en cours de l'X-gal, qu'on ajoutait au milieu de culture pour faire exactement la même selection par la couleur. Est-ce que c'est en fai la même chose que l'IPTG, mais avec un nom différent ? D'après la description de la méthode par mon prof, ce doit être la même chose...

merci si vous pouvez m'éclairer

[MaliciaR]

Hello,

Ce que je sais, c'est que quand on insert un fragment d'ADN, on s'arrange souvent pour le mettre en plein dans LacZ, qui code pour la beta-galactosidase. Comme il ne peut plus produire cette enzyme, le lactose n'est plus dégradé.
Là, si j'ai bien compris, on utilise l'IPTG à la place du lactose, parce qu'il lui ressemble beaucoup, et qu'il n'est pas dégradable par la cellule. Celles qui ont un plasmide sans ADN ont leur gène complet et l'utilisent à la place du lactose, normalement. Et celles qui ont un insert ne peuvent pas, donc il y reste. Et comme il est de couleur bleue, on peut repérer celle qui l'ony utilisé ou non.

Tu as compris le fond des choses, mais il faut vraiment travailler l'expression La partie que j'ai soulignée dans ton post surtout est sujette à confusion.

Alors, il y a plusieurs choses à retenir ici :
* IPTG est un inducteur de l'opéron lactose, mais n'est pas un substrat de la bêta-galactosidase: on appelle ça un inducteur gratuit. Il induit donc la production de la bêta-galactosidase mais elle ne le métabolise pas (c'est la différence avec le lactose).
* X-gal est un substrat de la bêta-galactosidase qui donne un produit bleu : ça s'appelle un substrat chromogène (génère un produit coloré) qui est en l'occurrence bleu. L'ONPG est un substrat chromogène de la bêta-galactosidase aussi.

Si cette explication est bonne, je me pose une autre quetion : on nous a parlé en cours de l'X-gal, qu'on ajoutait au milieu de culture pour faire exactement la même selection par la couleur. Est-ce que c'est en fai la même chose que l'IPTG, mais avec un nom différent ? D'après la description de la méthode par mon prof, ce doit être la même chose...

merci si vous pouvez m'éclairer

Le crible bleu/blanc repose sur le fait que :
* si j'ai un gène lacZ fonctionnel, il produira la bêta-galactosidase; si j'ajoute X-gal dans le milieu, les bactéries possédant ce gène lacZ fonctionnel produiront la béta-galactosidase et lemétabolisme de l'X-gal se fera : les colonies seront donc colorées en bleu (sur milieu supplémentée en X-gal, j'insiste);
* si j'ai un gène lacZ non fonctionnel, il n'y aura pas de production de la bêta-galactosidase, donc le X-gal ne sera pas métabolisé : les colonies seront blanches sur milieu supplémenté en X-gal.

Je pense que ça répond à ta question... Si ce n'est pas clair, n'hésite pas à demander


Cordialement,

[ptitsouris]

merci pour la réponse. Je vais essayer de m'exprimé un peu plus précisement pour la suite. Mais comme ça n'était pas encore très clair, j'avais du mal à reformuler.
IPTG et X-gal sont donc toujours utilisés ensembles quand on veut faire une selection selon la couleur...
Un dernier point le semble un peu sombre : l'IPTG permet d'induire la production de beta galactosidase (quand LacZ est fonctionnel), qui utilisera le X-gal, dans le cas de LacZ fonctionnel. Mais alors, pourquoi n'utilise-t-on pas tout bêtement directement du lactose, dans un milieu supplémenté en X-gal, pour induire la production de beta galactosidase ? Est-ce que c'est parce que l'enzyme préférerait alors utiliser seulement le lactose, et pas le X-gal, et donc on ne pourrait voir aucune différence entre les bactéries ?

[MaliciaR]

merci pour la réponse. Je vais essayer de m'exprimé un peu plus précisement pour la suite. Mais comme ça n'était pas encore très clair, j'avais du mal à reformuler.

Oui, absolument... J'espère que ça va mieux maintenant et que tu y vois plus clair

Mais alors, pourquoi n'utilise-t-on pas tout bêtement directement du lactose, dans un milieu supplémenté en X-gal, pour induire la production de beta galactosidase ? Est-ce que c'est parce que l'enzyme préférerait alors utiliser seulement le lactose, et pas le X-gal, et donc on ne pourrait voir aucune différence entre les bactéries ?

Beh tu peux utiliser directement le lactose, mais il sera métabolisé : donc, dès que le lactose sera épuisé, beh tu n'auras plus de béta-galactosidase produite. Et puis, n'oublie pas toutes les histoires de diauxie qui feront que l'opéron lactose ne sera plus induit dès que le glucose commencera à être un peu trop présent... Il ne faut pas oublier non plus que l'IPTG est un inducteur plus fort que le lactose. Sans parler que si tu as juste un plasmide avec lacZ dessus, mais un opéron non fonctionnel sur le chromosome, tu peux toujours espérer que le lactose entre dans la cellule : c'est la perméase codée par lacY qui est responsable de l'entrée du lactose. Ce n'est pas le cas de l'IPTG qui rentre par diffcusion simple, que lacY soit fonctionnel ou pas.
Bref, il y a tout un tas de choses qui font que l'IPTG est préférable au lactose


Cordialement,