Electrophorèse d'un plasmide avec 5 bandes

[invite7513c193]

Bonjour,
Je suis étudiant et j'ai un problème pour l'interprétation d'un gel, en effet après extraction d'un plasmide, j'obtiens non pas les trois bandes attendus (super enroulées, linéaire, et circulaire), mais cinq bandes, après recherche j'ai trouvé qu'il peut y avoir deux explications :

- Soit une bande correspondant à une association de plasmides, et une correspondant a un ADN simple brin

- Soit différentes formes plus ou moins enroulées


J'aimerais savoir si une explication est plus probable qu'une autre.

Et si il est possible que plusieurs plasmides s'associent pour former un duplex ou plus, et si quelqu'un peut m'expliquer ou me donner un lien pour comprendre ce phénomène.
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[jmbowie]

Bonjour,
Je suis étudiant et j'ai un problème pour l'interprétation d'un gel, en effet après extraction d'un plasmide, j'obtiens non pas les trois bandes attendus (super enroulées, linéaire, et circulaire), mais cinq bandes, après recherche j'ai trouvé qu'il peut y avoir deux explications :

- Soit une bande correspondant à une association de plasmides, et une correspondant a un ADN simple brin

- Soit différentes formes plus ou moins enroulées


J'aimerais savoir si une explication est plus probable qu'une autre.

Et si il est possible que plusieurs plasmides s'associent pour former un duplex ou plus, et si quelqu'un peut m'expliquer ou me donner un lien pour comprendre ce phénomène.

Le plus simple à mon avis, c'est qu'il y ait plusieurs formes plus ou moins sur-enroulées (topoisomères). Pour le confirmer, essaie de regarder s'il ne reste qu'une seule bande après digestion par une enzyme qui ne coupe qu'une fois dans ton plasmide.

[MaliciaR]

Salut,

Pourrais-tu préciser les tailles respectives?
Envisage aussi la possibilité "nicked plasmid" (une seule coupure simple-brin, l'autre brin restant intact, forme circulaire)

Pour quelle(s) raison(s) dis-tu que tu as envisagé la possibilité d'un plasmide simple brin? Ca me paraît un peu... bizarre

Cordialement,

[piwi]

Le coup du plasmide simple brin n'est jamais évoqué dans les cours alors qu'il est relativement fréquent d'en sortir lors des preps. Il passe inaperçu lors d'un clonage classique vu que la bactérie va s'empresser de synthétiser le complémentaire. Le problème c'est que cet abruti ne peut pas être coupé par les enzymes de restriction. Pénible, il vous fait du bruit de fond et vous pourri vos clonages.

Donc faut pas l'oublier

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

Alors, là... Ce que tu dis, Piwi, est parfaitement logique et ... totalement passé sous silence en cours! Autant dire que jamais aucun encadrant de stage (j'en eu 4 tout de même...) n'en a parlé non plus

Bon à savoir, en tout cas

Cordialement,

[Yoyo]

salut

comment tu fais pour obtenir de l'ADN simple brin a partir d'un ADN double brin? j'ai un peu de mal a comprendre dans la mesure ou pour avoir du simple brin il faut passer par des plasmides possedant une origine F1 pour faire du rolling circle.

Je vois pas d'ou proviens ce simple brin.

Yoyo

[MaliciaR]

(...)dans la mesure ou pour avoir du simple brin il faut passer par des plasmides possedant une origine F1 pour faire du rolling circle.

Je vois pas d'ou proviens ce simple brin.

Yoyo

Beh tous les plasmides "classiques" que l'on utilise l'ont, non? Les pET, oui, en tout cas...

Cordialement,

[piwi]

durant la prep.
Tu dénatures le plasmide et normalement il se renature quand tu passes en acétate de potassium. Du coup là tu peux avoir du simple brin qui apparait et c'est vite fait. Un peu trop longtemps dans une sauce, pas assez dans l'autre et hop t'en récupères.

[Yoyo]

Beh tous les plasmides "classiques" que l'on utilise l'ont, non? Les pET, oui, en tout cas...

Cordialement,

Oui mais sans un phage helper ta aucune chance que ton origine F1 soit active

durant la prep.
Tu dénatures le plasmide et normalement il se renature quand tu passes en acétate de potassium. Du coup là tu peux avoir du simple brin qui apparait et c'est vite fait. Un peu trop longtemps dans une sauce, pas assez dans l'autre et hop t'en récupères.

OK mais ce n'est donc pas vraiment un simple brin, les deux brins d'ADN sont tout de meme enchevétrés ensemble.
Tu le denatures a quel etape de la prep? en soude? parceque je ne pense pas que la soude separe les 2 brins, ca depurine les bases mais je n'ai jamais entendu parler de la séparation des brins.

YOyo

[invite7513c193]

Merci pour les réponses, donc la supposition la plus probable est qu'on ait un ADN simple brin et un assemblage de plusieurs plasmide.
Même si c'est vrai qu'il faudrait faire une vérification par enzyme de restriction.

Mais comment le simple brin a t'il pu être récupéré alors que je croyais que les ADN simple brin devaient précipiter lors de la centrifugation, car étant insoluble ?

Et sinon par quels mécanismes les plasmides peuvent ils s'assembler entre eux ?

[MaliciaR]

Hello,

Même si c'est vrai qu'il faudrait faire une vérification par enzyme de restriction.

Quels sont les contrôles que tu as faits lors de cette migration?

Mais comment le simple brin a t'il pu être récupéré alors que je croyais que les ADN simple brin devaient précipiter lors de la centrifugation, car étant insoluble ?

Et quid du double-brin alors?

Je ne comprends pas ta question, peut-être faute de café mais : tu centifugies tout ton tube avec l'intégralité de son contenu = différentes espèces d'ADN, donc l'ADN précipite au fond et tu n'enlèves que le surnageant, le culot étant à la fin resuspendu dans du TE ou dans de l'eau.
Donc, pourquoi de l'ADN simple-brin ne serait pas récupéré?

Cordialement,

[invite7513c193]

Hélàs aucun contrôle, ça c'est le problème des TP de cours où on a le temps de rien.


Sinon l’ajout d’une solution d’acétate de sodium sert à renaturer l'ADN, une renaturation brutale doit alors être amorcée.
Pour que l'ADN chromosomique, très long ne parvienne pas à se réapparier complètement et sera alors insolubles. Alors que l'ADN plasmidique, qui lui est court, parviendra à se reformer et restera en solution.
Après on centrifuge pour faire tout tomber dans le culot, et donc j'imaginais que l'ADN simple brin était insoluble et donc tombait aussi dans le culot.

[MaliciaR]

Hélàs aucun contrôle, ça c'est le problème des TP de cours où on a le temps de rien.

On vous apprend une démarche scientifique ou quoi? C'est quand même incroyable de faire faire des TP sans contrôles sous prétexte que le temps ne suffit pas... Autant ne pas faire de TP.

Tu peux tout de même préicer les tailles de tes bandes? Bon courage


Cordialement,