Travaux pratiques de biochimie des systemes integrés urgents

[Joanne_h]

Salut tout le monde, je travaille sur un projet qui consiste à formuler un fascicule de TP formé de 10 manipulation dans la biochimie des systemes integres( structure et dynamique de la membrane,compartimentation cellulaire et transport des proteines,recepteurs signalisation cellulaire et transduction du signal). J'ai une difficulté atroce à trouver des TPs appropriés. J'ai dejà trouver 2 western blot et traffic cellulaire. Est-ce que quelqu'un aurait une idée de TPs qui pourraient se faire à ce sujet et dont je pourrais trouver les informations nescessaires sur internet avec un mode opératoire convenable?
Merci d'avance.

[Aqualung]

Bonjour,
De quoi disposes-tu comme matériel? As-tu possibilité d'obtenir des membranes biologiques? Des sondes à 02, à ATP...? Ou encore des marquages par immunofluorescence?
Décrit nous le matériel à ta disposition, une fois fait il existe de nombreuses expériences... notamment un marquage de protéine par anticorps marqués qui sont suivit au court du temps par microscopie optique (ça permet de montrer la dynamique membranaire avec des méthodes d'extinction ou autres.)

Tout dépendra de tes réponses

[Joanne_h]

Le materiel n'est pas un probleme car ce sera juste un projet sur papier donc peu importe le materiel utilise meme s'il n'est pas a ma disposition.Alors vous pouvez me passer n'importe quel TP applicable a un tel cours. Ca fait des jours que je me casse la tete pour trouver quelque chose d'interessant mais j'y arrive pas
Merci beaucoup.

[Aqualung]

Pour les questions de transports et trafic cellulaire je ne vois que le marquage par fluorescence (soit une construction couplée à la GFP ou une hybridation in vivo bien que je ne sache pas si c'est possible sur les plantes, genre avec des RNA interférence marquée)
Pour le turnover de la membrane tu peux utiliser les techniques de FRAP et de FLIP ça consiste à éteindre la fluorescence par endroit et regarder si les endroits en questions récupèrent de la fluorescence...

Il existe aussi des techniques mettant en évidence les transports d'ions et autres à travers les membranes, ça nécessiterait des sondes à certains ions.

Je t'énumère les possibilités, je ne possède pas de réel protocole quoique pour la première solution et la dernière je peux voir avec toi je connais bien les marches à suivre.

[Joanne_h]

merci pour ta reponse.Moi mon travail concerne les cellule animale et humaine non vegetale.Est-ce que tu aurais un bon protocol experimental pour l'extinction par fluorescence pour la dynamique de la membrane dont tu m'as parle dans ton premier message ou bien une autre methode dont tu as un bon protocol experimental car moi mon probleme c'est de retrouver les protocoles experimentaux car j'ai les noms de methodes mais je ne trouve pas les protocoles et je suis a court de temps le travail doit etre rendu lundi matin et je deprime!! merci beaucoup de ton aide.

[Aqualung]

Arg désolé je n'ai pas de protocoles tout fait comme ça, j'en ai pour des choses simples (extractions DNA, RNA...) mais là en général je fais le protocole sur moment
En général juste pour la fluorescence tu transfecte la cellule avec un plasmide contenant la protéine d'interet suivie de la GFP (ou EGFP pour les eucaryotes je pense) Il s'agit d'une construction à faire à l'aide par exemple d'un plasmide EGFP dans lequel tu insères ta séquence d'interet (mais les manips sont longues, il faut compter un mois au moins). Une fois transfecté soit tu utilise un microscope à fluorescence simple pour visualiser où se trouvent les protéines marquées ou pour la technique du FRAP ou FLIP il faut un appareil spécifique qui utilise un laser pour éteindre la fluorescence à un endroit précis et calculer le recouvrement de fluorescence.

Le protocole de ceci comprend une première PCR pour produire ton gène d'interet à l'aide de primer possédant des extrémités suplémentaires contenant un site de restriction semblables à ceux présents sur ton plasmide EGFP
Tu produits et purifie ce fragments, puis tu le clive aux extrémités pour former les "bouts colants", tu produits et linéarise EGFP de la même manière. Tu utilise une simple T4 ligase pour les rassembler et tu le produit en quantité suffisante.
Une fois récupéré tu le transfecte dans des cellules genre HeLA pour voir où la protéine voulue se localise. Ensuite les techniques de microscopies sont plus poussées, je ne les connais pas moi même par coeur. Je m'excuse.

[Joanne_h]

merci en tout cas d'avoir essayer de m'aider. c'est pas grave je ve essayer de me traccasser la tete encore je ne sais pas ce que ca va donner!! merci

[Joanne_h]

en fait est-ce que tu as pris des cours de biophysique cellulaire ou de biochimie cellulaire? si oui tu as eu des TPs dans ces cours?

[Aqualung]

Oui et oui concernant les deux questions, je n'ai jamais mis moi même en place le protocole de FRAP et FLIP mais j'ai effectué les constructions pour... Et sinon oui je termine mon master en biochimie cellulaire et moléculaire