Que devient l'ARNr dans une reaction de RT

[invitee3a37ddc]

Bonjour,
j'ai une petite question à résoudre et elle m'a été posé par une stagiaire.
Voila, nous avons effectué ensemble une extraction d'ARN total (à partir d'embryon de zebrafish) en utilisant un Kit (avectraitement à la DNAse). Pour vérifier la qualité des nos ARN nous en déposons 1µl sur une puce ARN Nano bioanalyser agilent. Nous y avons vu nos deux beaux pics d'ARNr 18 et 28S avec un RIN de 10. Jusqu'ici rien d'anormal. Nous poursuivons donc notre manipe en faisant une réaction de rétrotranscription en utilisant une superscript II, des oligos DT (20). Comme je suis prudente, je dépose également mes cDNA sur sur puce ARN nano histoire de vérifier que j'ai une belle smire. C'est effectivement le cas avec nos echantillons et la mon étudiante me pose une colle : mais ou sont passés les ARNr ???
Effectivement, je n'ai pas utilisé de RNAse, ma transcriptase reverse a une petite activité RNase H (élimine les ARN des Hybrides ARN:ADN), j'utilise des oligo DT pour que ma RT soit spécifique des ARNm...alors dans mon tube de RT j'ai de l'ARN total, donc quand je depose moin cDNA sur puce, j'ai de L'ARNt, l'ARNr l'ARNm et du cDNA...alors ou sont passés mes ARNr?
Si vous avez une reponse eclairez ma lanterne ! je suppose que ca doit etre simple mais la je seche !
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[wishangel]

Salut,

je suis pas sur car je connais pas trop la manip mais peut être que la dilution est suffisante pour que tes ARNt n'apparaissent plus..
J'espère que ce mystère sera résolu ^^

Bonne soirée

[invite6487dc7f]

Je ne suis qu'un petit étudiant qui n'y connait pas grand chose mais en lisant ton texte une idée m'est venue.
A un moment donnée tu a eu en solution ton cDNA et ton ARNr et une RNAse H (qui si j'ai bien compris hydrolyse l'ARN double brin).
Donc ça se trouve ton ARNr c'eswt hybridé à l'ADNc et a été hydrolysé par la RNAse H.
Les deux brins étant complémentaires l'un de l'autre il doit y avoir un certain équilibre simple brin double brin.
Voila, idée a confirmée (ou pas )

[piwi]

La RNase H hydrolye l'ARN quand il est en duplex ARN//ADN.
Ensuite je ne vois pas pourquoi l'ARNr serait complémentaire à l'ADNc issu des ARNm.

Moi je vois comme explication:
soit une dilution effectivement. (quand je prépare des ADNc je pars d'1µg d'ARN qui se trouvent en général dans 1µl et qui sont dilués au final dans 200µl. Si vous procédez un peu de la même manière ça fait tout de même une belle dilution.)

soit des conditions d'hydrolyses chimiques ménagées des ARNs qui permettrait d'initier la reverse transcription mais qui à terme dégradent les ARN. Je ne connais pas votre kit.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[Moumoutte]

Bonjour,

oui, effectivement je penche aussi pour les effets d'une dilution. Comme le dit Piwi, il faudrait voir quel volume final vous obtenez à la fin de la RT.

Il faut également voir l'échelle du graphe (l'axe des ordonnées, la fluorescence je crois) que vous obtenez à la fin de votre analyse sur le bioanalyser: peut être tout simplement les pics ribosomaux sont noyés dans la masse des ARNm.

Par contre, j'aurai une petite question un peu plus technique si vous voulez bien: vous dites que vous passez vos ADNc sur une puce ARN nano: ça marche? Ne faudrait-il pas une puce ADN?
Ceci expliquerait peut être vos résultats: lorsque que j'utilise les puces ARN nano et que j'obtiens une smire, c'est généralement une contamination ADN (ou de l'ARN dégradé)

Bonne soirée

[Yoyo]

SAlut

J'ai du mal a croire a la dilution. Les ARNr sont par définition plus abondant que les ARNm, donc plus abondant que les cDNA... d'ailleur quand je depose sur gel mes produits de RT je vois toujours mes ARNr.
Maintenant si la RT se fait a une températur > a 50°c il y a hydrolyse des ARNr et donc on les "perds".

Yoyo

[invitee3a37ddc]

Bonjour à tous,
Pour la thèse de la dilution ce n'est pas ça, je travaille souvent avec peu de matériel, j'utilise bien 1µg d'ARN pour faire mon cDNA que j'utilise dans un volume total de 40µl...la dilution n'est donc pas très élevée.
La théorie de l'hybridation de l'ARNr et du cDNA n'est pas si bête mais je ne suis pas sur que se soit vraiment cette théorie. D'autant que les transcriptases reverse ont effectivement une activité RNaseH mais celle que j'utilise à une mutation qui limite cette activité...donc en théorie elle ne devrait quasiment pas dégradé mes hybrides justement.

[invitee3a37ddc]

Alors...
1/ concernant l'échelle: effectivement j'ai une échelle différente sur mes graphes: pour l'ARN je vais jusqu'à 30 fu (unité de fluorescence) pour mes cDNA à 3 mais si je vois mon ARNr à 30 Fu je devrais le voir d'avantage à 3 Fu sauf si il a été dégradé, étant donné que pour une efficacité de 100% de ma RT, 1 brin d'ARNm est transformé en ADNc, je devrais avoir dans tous les cas, toujours moins d'ADNc que d'ARNr (80% environ des ARN).
2/ je crois qu'on a un gagnant: je dépose effectivement mes cDNA sur des puces ARN nano, et je viens de vérifier que le dye est spécifique de mes ARN donc sur mon graphe je ne vois pas mes cDNA mais mes ARNs qui sont effectivement dégradés. Mais ils sont dégradés par quoi? la température ?: pas possible que se soit mes ARN ou mes ADN je les chauffes à 70°C pour éliminer les repliements. L'enzyme? non plus pas d'activité RNase

[Yoyo]

Salut

Au fait ca marche comment ces puces, tu aurais un lien?
c'est mieux que de faire un gel?

Sinon oui la température a un effet tres important sur la stabilité des ARN, je ne sais pas combien de temps tu les chauffes a 70, mais par expérience ca se casse la geule tres rapidement.

YOyo

[invitee3a37ddc]

Il s'agit du bioanalyser2100 De chez Agilent :

http://nano.tm.agilent.com/index.cgi...LANGUAGE=en-US

C'est un appareil un peu cher mais très très fiable. il a plusieurs avantage (je fais un peu une pub là!)
1/ tu utilise très peu d'ARN pour tes analyses (très bien pour les ARN précieux)
2/ une puce (c une toute petit plaque avec 16 mini puits) dans chaque puits tu dépose un gel qui contient un Dye spécifique de ton ARN (contrairement au BET) tu ajoutes ensuite un tampon et un ladder de poids moléculaire. L'appareil analyse tes échantillons 1/1 en commençant par le marqueur qui sert de PM et d'étalon. Chaque puits contient un micro réseau dans lequel il y a le gel de séparation qui va être en contact avec une électrode, cette électrode sera soumise à un haut voltage qui va séparé tes ARN sur le Gel en fonction de leur taille. Quand les ARN passent dans le gels ils se lient au dye et à la fin du micro réseau la fluo sera detectée par la machine et tu vas obtenir un graphe avec les fluo et le temps de rétention sur le gel. donc tu as soit des données qualitatives et quantitatives.

[invitee3a37ddc]

ah je chauffe mes ARNs 2 min à 70°C

[wishangel]

Salut,
Ça semble assez intéressant comme machine ça. Du coup j'ai plusiseurs questions ^^

Quand tu dit un peu cher c'est de quel ordre? Est ce que ça fait longtemps que vous en êtes équipé? Est-ce que tout les utilisateurs sont satisfait? Est-ce suffisamment simple d'utilisation?
J'ai bien peur que le prix soit limitant qd mm... enfin on peu toujours rêver^^

[invitee3a37ddc]

Concernant le prix, je ne sais pas il faut se renseigner chez les fournisseurs (Interchim ou Agilent), mon laboratoire n'en possède pas, mais je travaille dans un centre ou il y une plateforme de génomique et de protéomique. Donc je paye pour l'utiliser.
Nous sommes un grand nombre d'utilisateur, et nous en sommes je crois tous très très contents.
Je fais de la Q-PCR donc c'est vraiment important pour moi de vérifier la qualité de mes ARN. L'avantage c'est qu'on peut déterminer la quantité et l'intégrité de nos ARN en une seule manipe grâce au fameux RIN. Voici un lien d'une publi sur l'importance de l'intégrité de l'ARN:
http://www.biomedcentral.com/content...1-2199-7-3.pdf
C'est extrêmement facile d'utilisation :
Il faut remplir une puce avec ton gel+dye avec un système de pression (c une seringue que tu fixe et qui va repartir le gel dans la puce de maniere homogène c'est l'étape délicate et elle dure 30 s exactement !), tu place ton marqueur dans les puits, tu places tes échantillons et tu mets ton ladder, tu vortex et hop dans la machine...
En tout c 30 min 12 échantillons au temps de temps qu'un gel mais en plus tu l'a dosé et tu as la photo et un electrophorégramme !

[invitee3a37ddc]

Hello,
Bon nouveau rebondissement en appelant Agilent (ils commercialisent les puces ARN) le dye n'est pas spécifique des ARN mais des Acides nucléiques simple brins , donc l'ARNm libre, les ARNr et mon cDNA sont marqués.
Donc retour à la case départ, mes ARNs sont dégradés et j'ignore toujours pourquoi vu que je ne les détruits pas. En plus je mets de la RNase OUt qui inhibe justement les RNase...à 42°C pendant 1h mes ARN sont censés être encore en bon états etant donné que je les utilises comme matrice de ma rétrotranscription...je sèche!
J'avoue que je deviens chèvre, si vous avez d'autres théories...

[Moumoutte]

Re-bonjour,

il y a quelque chose que je ne saisis pas: vous dites que vous n'avez pas utilisé de RNAse H et que votre reverse transcriptase est mutée pour ne pas avoir d'activité RNAse H.
Peut être avez-vous donc un certain nombre d'hybrides ARN:ADN non dégradés? Serait-ce possible?
Et puisque le dye est spécifique des acides nucléiques simple brin...

Autre chose: si vous le pouvez ce serait bien de nous faire part de votre graphe que sort le bioanalyser, histoire de voir où ce trouve ce smear.

De plus, j'ai fait un rapide calcul: vous dites que vous avez un volume final de 40 microlitre à la fin de la RT et que vous mettez 1 microgramme d'ARN. Si mon calcul est juste, cela vous donne une concentration de 25 nanogramme/microlitre: attention vous êtes à la limite de détection d'une puce ARN Nano. (Il est donc possible que les pics ARNr soit tous petits et donc pas forcément visibles...)

Bonsoir